doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2021.03.042
收稿日期:2020-04-15；最后修回日期:2020-05-21
基金项目：国家自然科学基金项目(31500276)；四川省应用基础研究项目(2017JY0222)；四川省重点研发项目(2018SZ0061)；成都市科技
惠民技术研发项目(2016-HM01-00260-SF)
作者简介：李超林，硕士，研究方向为结构生物学,E-mail:840986540@qq 通信作者：廖㊀海，博士，副教授，主要从事生物技术研究,E-mail:ddliaohai@aliyun；周嘉裕，博士，副教授，主要从事生物技术研究,
E-mail:spinezhou@aliyun
李超林，张㊀田，邹㊀萌，廖㊀海，周嘉裕
(西南交通大学生命科学与工程学院，成都610031)
摘㊀要㊀决明胰蛋白酶抑制剂(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor,CoTI)是植物Kunitz 蛋白酶抑制剂家族的一个成员,
对胰蛋白酶具有较强的抑制活性㊂利用同源建模预测CoTI 的三维模型，发现其形成了β-三叶草型三维结构，由底部的β-桶与顶部的盖子区域组成㊂通过氨基酸序列和三维模型比对，发现CoTI 含有一个保守的Trp114残基，该残基位于盖子区域，与β-桶的Leu98和Ser137形成氢键，其侧链伸向Barrel，和Val68㊁Leu98㊁Phe100等形成疏水作用，推测其在β-三叶草型三维结构的形成与稳定中发挥重要作用㊂使用定点突变技术将Trp114残基突变为Ala 残基后，相比于野生型CoTI,CoTI Trp114Ala 突变体对牛胰蛋白酶和菜青虫中肠类胰蛋白酶的抑制活性分别下降63.4%和62.0%，证 明Trp114残基对发挥CoTI 抑制活性的重要性㊂结果为CoTI 的结构-功能研究及相关的应用奠定理论基础㊂关键词㊀决明；胰蛋白酶抑制剂；同源建模；疏水核心；定点突变中图分类号㊀Q71;Q51
文献标识码㊀A
文章编号㊀2095-1736(2021)03-0042-05
Homology modeling and site-directed mutagenesis of
Cassia obtusifolia trypsin inhibitor
LI Chaolin,ZHANG Tian,ZOU Meng,LIAO Hai,ZHOU Jiayu
(School of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031,China)
Abstract ㊀Cassia obtusifolia trypsin inhibitor (CoTI),a member of plant Kunitz protease inhibitor family,shows strong inhibitory ac-tivity against trypsin.In this paper,the three-dimensional model of CoTI was predicted by homologous modeling.The model adopted a β-trefoil fold with β-barrel at the bottom and the lid at the top.Then,compared with the amino acid sequences and three-dimensional
structures of various Kunitz protease inhibitors,a conserved Trp114that was located in the lid region and extended to the β-barrel was
found in the CoTI model.Since Trp114formed hydrogen bonds with Leu98and Ser137,hydrophobic interaction with Val68,Leu98and Phe100,it was suggested to play an important role in the formation and stability of β-trefoil fold.After mutation of Trp114residue to Ala residue using site-directed mutagenesis technique,the inhibitory activities of Trp114Ala mutant against bovine trypsin and Pieris-rapae midgut trypsin were decreased by 63.4%and 62.0%,respectively.As a result,the importance of Trp114would lay a theoretical foundation for the study of structure-function of CoTI and its related applications.
Key words ㊀Cassia obtusifolia ;trypsin inhibitor;homology modeling;hydrophobic core;site-directed mutation
㊀㊀Kunitz 蛋白酶抑制剂(Kunitz protease inhibitor,
KPI)是存在于植物中的一类活性肽，能够与胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶形成复合物，竞争性抑制靶酶的活性[1]㊂
KPI 在植物抵抗生物及非生物胁迫中发挥重要作用，具有抗虫㊁抗肿瘤㊁抗感染㊁抗病毒和抗真菌等多种生物学
活性㊂牛蓓等[2]将麻疯树Kunitz 型蛋白酶抑制剂基因转入烟草中，通过叶片饲养棉铃虫幼虫实验证明，转基因植株对棉铃虫具有一定的抗虫性;Fang 等[3]从韩国大黑豆中纯化出Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂，能够抑制HIV-1反转录酶的活性，具有抑制HIV-1病毒增殖的潜能㊂
分析大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibi-tor,STI)等KPI家族成员的三维结构晶体，发现它们具有典型的β-三叶草(β-trefoil)型三维结构㊂该类结构包含了一个由12个反向平行β-折叠组成的疏水核心，其中6个β-折叠形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6个β-折叠形成疏水核心顶部的盖子(Lid)㊂该疏水核心的稳定性对于整体结构的维系发挥关键性作用㊂根据序列比对分析，发现疏水核心中存在较多的
芳香族与脂肪族等疏水性氨基酸，推测它们通过疏水作用和氢键与邻近的氨基酸相互联系，参与核心结构的形成与稳定㊂由此，确定这些疏水性氨基酸并认识其作用能够有助于认识β-三叶草结构形成的分子机制，并对未来的结构改造具有指导作用㊂
决明(Cassia obtusifolia)为豆科决明属植物㊂实验室在前期研究中，从决明种子中克隆得到决明胰蛋白酶抑制剂(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor,CoTI,Gen-Bank登录号AIU39184.1)基因的全长cDNA序列，并获得有活性的重组蛋白[4]㊂分析CoTI氨基酸序列，发现CoTI与其他KPI成员均含有1个保守的Trp114残基，随后利用同源建模的方法预测CoTI的三维结构及Trp114残基在三维结构中可能的作用，最后通过定点突变对推测进行验证，为CoTI的结构研究及可能的分子改造奠定理论基础㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料
㊀㊀CoTI-pET28a重组大肠杆菌表达载体由本实验室构建并保存，大肠杆菌Rosseta(DE3)由本实验室保存；限制性内切酶㊁Prime star DNA聚合酶㊁T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司;BAPNA(N-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)购自Sigma公司；质粒提取试剂盒Omega Plasmid Mini Kit I㊁胶回收试剂盒Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品；定点突变系统Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2购自南京诺唯赞公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自MEKER公司；卡那霉素㊁氯霉素购自上海
生工生物工程有限公司㊂
1.2㊀方法
1.2.1㊀序列比对及同源建模壹读iread
㊀㊀从PDB数据库中选择同源建模的模板序列，其氨基酸序列与CoTI的一致性大于或等于30%，使用SWISS-MODEL对CoTI进行同源建模获得其三维结构㊂使用MEGA7.0进行多序列比对，使用PyMol对其模型进行可视化分析和处理㊂
1.2.2㊀模型验证
江普生利用PROCHECK和Verify-3D程序对模型进行评估㊂Ramachandran plot用于阐述肽平面内两个二面角(φ与ψ)的比值，以表明氨基酸残基的允许和不允许的构象，通过PROCHECK计算的Psi/Phi Ramachand-ran图来评估模型的立体化学可靠性[5]㊂蛋白质侧链氨基酸残基的兼容性通过Verify-3D进行评价[6]，至少80%的氨基酸残基得分ȡ0.2则通过验证㊂
1.2.3㊀CoTI基因的定点突变
定点突变采用ClonExpress公司生产的Mut Ex-press II Fast Mutagenesis Kit V2，基于一步法[7]，利用CoTI-pET28重组载体为模板，根据W114所对应的核苷酸设计突变引物(表1)㊂
表1 突变引物及其序列
Table1㊀Mutation primers and their sequences
以药养医引物
Primer序列(5ᶄ-3ᶄ)
Sequence
W114A1CTCCGATGCGATCATCAAATCCTCCAACGACTTCGAGGG W114A2ATTTGATGATCGCATCGGAGTTTTTGGTGCACACGTTGG PCR反应体系总量为50μL，在美国Applied Bio-systems公司Veriti96孔快速PCR仪上进行㊂PCR反应条件:95ħ预变性30s;95ħ变性15s,63ħ退火15 s,30个循环;72ħ延伸50s；最后72ħ再延伸300s㊂突变质粒DNA的片段回收㊁酶切㊁克隆㊁转化方法均参照文献[8]和试剂盒说明㊂最后突变体菌株提取质粒㊁酶切和PCR鉴定，送往成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，验证突变的正确性㊂
1.2.4㊀突变体的表达㊁纯化及活性检测(1)参照文献[8]：突变体菌株在含卡那霉素和氯霉素的液体LB培养基中37ħ㊁200r/min培养到A600值为0.6~0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，过夜诱导表达(27ħ,180r/min)㊂诱导菌液使用超声破碎仪(总时长为30min，超声3s/间隙3s，功率45W)进行破碎，经
Ni2+亲和柱纯化后得到纯化突变体㊂(2)突变体的活性检测参照文献[9]：采用BAPNA(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)为胰蛋白酶底物，活性检测实验重复3次㊂(3)菜青虫中肠胰蛋白酶提取方法参考文献[9]：取4~5龄虫固定于滴有石蜡的托盘，托盘置于冰上，截取菜青虫中肠及其内含物，用液氮研磨成粉末，加入150mmol/L NaCl溶液1mL，制成匀浆，于冰浴中抽提蛋白10min后，使用12000r/min,4ħ离心15min，取上清液即为中肠酶液,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，保存于-80ħ备用㊂
1.2.5㊀突变体的荧光光谱检测
平衡CoTI和突变体蛋白液的终浓度为1.0mmol/L，然后用日本日立公司F-7000光度计测定相应的吸光
值㊂检测条件限定为:280nm的激发波长，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为10nm，扫描速度为
1200nm/min，在荧光分光光度计上记录CoTI和突变体蛋白在300~400nm范围内的荧光发射光谱㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀序列比对和同源建模
㊀㊀Blast结果显示:CoTI的氨基酸序列与大豆胰蛋白酶抑制剂STI(Soybean trypsin inhibitor,PDBid:1B
A7)同源性最高，达到了35%的序列相似性(图1)㊂因此，选择STI作为同源建模的模板㊂二级结构预测结果表明:CoTI与大多数Kunitz类胰蛋白酶抑制剂一样，由12个β折叠组成(图1)㊂CoTI模型与STI的RMSD为1.33,Z Score为10.4，表明这两者具有相似的三维整体结构㊂统筹区域发展
2.2㊀验证建模模型
使用PROCHECK和Verify-3D程序对CoTI模型进行评估㊂PROCHECK计算的Psi/Phi Ramachandran图结果表明CoTI模型的绝大多数φ㊁ψ二面角均处于合理范围内，其中允许区域占83.2%，最大允许区域占㊀㊀
㊀
图1㊀CoTI同源建模结构
Figure1㊀CoTI homology modeling structure
16.1%，不允许区域仅为0.7%，见图2(a)㊂Verify-3D
分析结果显示CoTI模型中有94.77%的侧链氨基酸残
基得分在0.2以上，具体见图2(b)㊂
(a)(b)
3
D
-
1
D
F Residue number
图2㊀拉氏图(a)和CoTI模型的Verify3D评价图(b)
Figure2㊀Ramachandran plot(a)and Verify3D evaluation graph of the CoTI model(b)
2.3㊀CoTI蛋白模型分析
像男人一样战斗
CoTI三维结构由12个反向平行β-折叠和13个loop环组成(图1)，含有两个二硫键(Cys64-Cys108㊁Cys156-Cys164)㊂CoTI的抑制中心环位于β4与β5之间，活性基序为L84-V85-R86-P87-T88，在与靶蛋白酶反应时，该Loop可能插入到胰蛋白酶的底物口袋中，从而发挥抑制作用㊂CoTI形成β-三叶草结构,12个反向平行β-折叠中的6个形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6个β-折叠形成疏水核心顶部的盖子(Lid)㊂Kunitz 丝氨酸蛋白酶抑制剂β桶蛋白疏水核心的包装是家族特异性的㊂CoTI的Trp114残基位于桶盖连接处㊂通过与其他Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂序列(ECTI[10]㊁STI[11]㊁DE-3[12]㊁DrTI[13]㊁TKI[14]㊁WCI[15]㊁BASI[16])比对可以看出，该残基在其他Kunitz蛋白酶抑制剂家族成员也高度保守(图3)㊂并且，将CoTI模型和其他Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂的三维结构重叠比对，也可以看到Trp114在三维结构上高度重叠㊂
通过分析CoTI的W114发现,CoTI中的W114位于LID的β6折叠始端，与Leu98和Ser137形成氢键，其侧链伸向Barrel，与Leu42㊁Val68㊁Leu98㊁Phe100㊁Val126㊁Met127㊁Leu128㊁Phe139㊁Leu153和Val179形成疏水作用，从而参与三叶草结构的包装并决定结构的稳定性(图4)㊂
为保守的W114
图3㊀CoTI 与其他Kunitz 丝氨酸蛋白酶抑制剂多序列比对图
Figure 3㊀Multi-sequence alignment of CoTI and other Kunitz serine protease
inhibitors
与W114形成疏水作用的氨基酸用灰表示；与W114形成氢键的氨基酸用白表示(Leu98与W114既形成氢键，又有疏水作用)；黑虚线代表氢键
图4㊀W114相互作用网络Figure 4㊀W114interaction network
2.4㊀突变体活性检测
经检测，菜青虫中肠蛋白酶液的比活力为
2.286IU /mg，表明菜青虫中肠中含有胰蛋白酶㊂图5表明:CoTI 对牛胰蛋白酶抑制效果显著，为204.92UI /mg,
而CoTI(W114A)突变体的抑制活力为74.97UI /mg，相较于野生型CoTI 下降了63.4%;CoTI 对菜青虫中
肠胰蛋白酶也具有明显的抑制活性，为167.7286UI /mg㊂而CoTI(W114A)突变体抑制活性下降了62%，仅为
63.92UI /mg㊂
2.5㊀突变体荧光光谱检测
蛋白质中的天然荧光生团为其芳香族氨基酸
与CoTI 组比较;∗∗∗
P <0.001
图5㊀CoTI 与CoTI(W114A)活性检测
Figure 5㊀CoTI and CoTI (W114A)activities test
(Trp㊁Tyr㊁Phe 等)，其中由氨酸残基发出的荧光占统治地位㊂通过对CoTI 和突变体进行荧光光谱检测,
由荧光光谱图(图6)分析可看出:CoTI(W114A)
发生
旅鼠的自杀之旅#K Wavelength/nm
F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y
9
图6㊀CoTI 与突变体的荧光光谱Figure 6㊀CoTI and mutant fluorescence spectra
了轻微蓝移(342.8nm蓝移至340.4nm)，荧光强度由318.2减弱到216.2，减弱了32%，可能原因是114位的氨酸突变为丙氨酸后，减少了蛋白质中的天然荧光发团，故荧光强度降低，且发生突变后，疏水腔内相互作用力减小，使得三维结构更加紧凑㊂
3㊀讨论与结论
尽管KPI家族成员的氨基酸序列保守性不高，但却具有相似的三级结构，可能原因是β折叠上的若干疏水氨基酸之间形成的分子间相互作用㊂通过同源建模方法，获得CoTI的三维模型，发现其三维模型为典型的β-三叶草结构，其中6个形成β-桶，另外6个形成封闭桶上方的盖子，此结构为β-三叶草结构蛋白质的常见基序㊂分析CoTI疏水核心，发现Trp114在Kunitz 家族中是高度保守的，其位于β-桶与盖子
的连接点处，不仅与Leu98和Ser137形成氢键，而且疏水侧链伸向β桶内部，与邻近的氨基酸Leu42㊁Val68㊁Leu98㊁Phe100㊁Val126㊁Met127㊁Leu128㊁Phe139㊁Leu153和Val179产生疏水作用㊂W114通过这些相互作用，紧紧地将盖子与桶的顶层缝合在一起，从而参与β-三叶草整体结构的维系并保持结构的稳定性㊂
向缅等[8]曾做过CoTI(R86D)突变体的表达及活性检测，结果相较于野生型，突变体对胰蛋白酶抑制活性下降了93%，从而证实Arg86为CoTI抑制胰蛋白酶的关键残基，且在发挥抑制作用的过程中起决定性的作用㊂而本实验通过对CoTI中W114进行单定点突变后发现：无论是对牛胰蛋白酶还是菜青虫中肠胰蛋白酶的抑制活性，突变体较野生型都发生明显下降，但抑制活性下降并没有CoTI(R86D)大，可能原因是Arg86作为CoTI与胰蛋白酶作用的关键残基，对发挥抑制作用至关重要，而W114则主要是作为维持蛋白质三维结构的关键残基，间接的影响抑制作用的发挥㊂荧光光谱检测发现,W114作为疏水腔内关键的氨基酸，当发生突变后，会使CoTI的整体构象发生改变㊂我们推测:Trp114残基突变为Ala残基后，原有的氢键与疏水作用随即减弱，甚至消失，会使整体结构趋于不稳定，进而影响抑制中心的构象，导致W114A突变体与靶蛋白酶的结合变弱，从而导致抑制活性的下降㊂研究证实W114是CoTI疏水核心中的一个关键残基，其在CoTI蛋白的折叠形成过程以及发挥抑制活性中起到了重要的作用，该结果为CoTI的结构功能研究及相关的应用奠定了理论基础㊂
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