.硏究.
Drug Research China Pharmaceuticals 2018年3月5日第27卷第5期Vol. 27, No. 5, March5, 2018
•检验检测•doi:10. 3969/j.issn. 1006 -4931. 2018. 05. 004
大黄有效成分含量*
曾雪145，陈竹2，，刘应杰1杨元娟1△，夏培元4
(1.重庆医药高等专科学校，重庆401331; 2.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121; 3.重庆市化学药
品质量控制与评价协同创新中心，重庆401121; 4.中国人民解放军第三军医大学西南医院，重庆400050;
5.重庆市药物制剂工程技术研究中心，重庆401331)
摘要：目的建议同时测定三黄片中大黄素和大黄酴含量的P-坏糊精修饰毛细管区带电泳法。方法采用超声辅助方法提取大黄有效 成分，分离柱为熔融石英毛细管柱(75 fxmx67.4復，有效长度51 cm)，缓冲溶液为60 mmol/LNa2B4〇7+40 mmol/LNa2C〇3，缓冲溶液 添加剂为40 mmol/L P-环糊精(pH= 8./)，检测波长为254 nm。结果三黄片中大黄素和大黄酚重复性试验的兄S Z)分别为1.76%和
1.53% U=6)，质量浓度线性范围分别为
2.0〜18.5 pg/m L和2.50〜1.56 x103盹/mL，平均加样回收率分别为9
3. 53%和97. 26%，
兄S Z)分别为0.83%和2.52% (^ =3)。结论该方法简单，结果准确，重复性好，可用于三黄片中大黄有效成分的含量测定。
关键词：三黄片；高效毛细管电泳法；大黄素；大黄酚
中图分类号：R284.1;R286.0 文献标识码：A文章编号：1006 -4931牗018)05 -0010-03
Content Determination of Active Ingredient of Rheum P l r n a t u m i n Sanhuang Ta p - Cyclodextrin Modified Capillary Electrophoresis
Zeng XueL4,5,Chen Zhu2,\L iu Yingjie1，Yang Yuanjuan1，Xia Peiyu (1. Chongqing Medical a n d P h armaceutic a l College，Chongqing, China 441331; 2. Chongqing Institute for Food Dru 441121; 3. Collaborative Innovation Center for Chemical M e d i c m i Q u a l i t y Control and
Affiliated to AUM，Souttwest Hospital，Chongqing, China 440455; 5. Chcrngqing
Chongqing, China 441331)
Abstract：Objective To establish a P- cyclodextrin modified capillary electrophoresis method for content determination of emodin and chrysophanol in Sanhuang Tablets.Methods Active ingredient of Rheu w as acquire detection was carried out with an uncoated fused- silica capillary牗5 (xm x67.4 cm,the effective length was51 cm).The buffer was
consisted of60 mmol/L Na2B4〇7+40 mmol/L Na2C〇3,and buffer additives was 40 mmol/L P_cyclodextrin(pH=8. 9). The detection wavelength was254 nm.Results RSDs of repeatability test of emodin and chrysophanol were 1.76% and 1.53% (n=6). The linear
ranges of active ingredient were 2.0 - 18. 5 x/^mL and 2.50 - 1.56 x103xg/mL.The average recoveries were 93. 53% and 97. 26%,
混流式风机
and RSD were0.83% and2. 52% (n = 3) .Conclusion The method is simple,accurate and reproducible,which can be used for
content determination of active ingredient of Rheum palrnatum i n Sanhuang Tablets.
Key words：Sanhuang Tablets;high performance capillary electrophoresis;emodin;chrysophanol
三黄片是2015年版《中国药典(一部)》收载的中成药，主要由大黄、盐酸小檗碱和黄芩浸膏组方，具有清热解毒、泻火通便功效犤_3]，主治三焦热盛、目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、心烦口渴、尿黄便秘。2015年版《中 国药典(一部)》采用高效液相谱(H P L C)法测定三黄片中大黄有效成分的含量[4]，但液相谱存在操作过程复杂，流动相处理要求高，试剂消耗量大等问题犤_9]。高 效毛细管电泳（H P C E)法是一种由经典电泳技术发展起来的分离分析技术，具有高灵敏度、高分辨率和低成本等优点，缓冲溶液处理简单，操作简便。该方法是液相谱法的有力补充，但国内相关研究非常少犤0-11]。本研究中采用P-环糊精修饰毛细管区带电泳同时检测三黄片中大黄活性成分大黄素和大黄酚的含量，现报道如下。
1仪器与试药
1.1 仪器
南平新闻九点半
Agilent C E7100型高效毛细管电泳仪（美国安捷伦公司）；S P D-15C型紫外检测器（日本岛津公司）；
G W A-U N1型超纯水器（北京普析通用仪器有限公司）；SK- 1型涡旋混合器(常州市国旺仪器制造有限公司）；A U X220电子天平（日本岛津公司）。
1.2 试药
三黄片（广西金诺制药有限公司，批号为120612201603) ;Na2B4〇7•10H20(分析纯，重庆北碚精细化工工厂，批号为S J Y160724 )无水碳酸钠（分析纯，重庆北碚精细化工工厂，批号为SJG160724)；羟
*基金项目：重庆市科委基础与前沿项目[c s t2014j c j A10125]；重庆市卫计委中医项目[zy20150242]；重庆市卫计委医学项目 犤012 - 1 -093]；重庆市教育委员会新技术推广项目[GZTG201604]；重庆医药高等专科学校科学技术研究项目[gz2015101]。
第一作者：曾雪，男，硕士研究生，讲师，研究方向为药学和中药学药物分析，（）1310891885@163. c m。
△通信作者：杨元娟，女，硕士研究生，教授，研究方向为药学及药物分析，（）yang- 188
9@S ina.c m。
磁选器10
2018年3月5日第27卷第5期
VoL 27, No. 5, March 5,2018 China Pharmaceuticals Drug Research荣誉的力量
丙基-P -环糊精(H P- p - C D，相对分子质量1 459. 8, A CR O S O R G A N IC S，New Jersey，U S A，批号为Q G11031); 大黄素（C15H i G〇5，批号为20160711牘大黄酚(C15H1()〇4，纯度>98.0% ，批号为20160848)，均购于美仑生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 电泳参数设置
分离柱：熔融石英毛细管柱（5 p m x67. 4 c m，有效长度51 cm，河北永年瑞丰谱配件有限公司）缓冲溶液：60 m m ol/L Na2B4〇7 + 40 m m ol/L Na2C〇3 + 40 m m ol/L HP- p - C D(PH = 8. 9)，供试品缓冲溶液与此相同；分离电压:15〜30 k V；进样方式：压差进样；进样时间:5 s；操作温度：5 °C ；检测波长：54nm。
2.2 溶液制备
取大黄素对照品和大黄酚对照品适量，精密称定，加 无水乙醇-乙酸乙酯(2: 1)的混合溶液，制成每1m L含大黄素10哗、大黄酚25哗的混合对照品溶液。取样品(批号为120612201603)20片，除去包衣，精密称定，研细(过3号筛）取约0. 26 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加人乙醇25 m L，称定质量，加热回流1h，放冷，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1m L，置烧杯中，蒸干，加30%乙醇-盐酸(10: 1)的混合溶液15 m L，置水浴中加热回流1h立即冷却，用强力振摇提取4次，每次15 m L，合并，蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2 : 1)的混合溶液溶解，转移至25 m L容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3 电泳条件优化
毛细管预处理：毛细管柱分别用0. 1m o l/L NaOH 冲洗活化10 m in，水洗5 m in，再用缓冲溶液冲洗5 m in。每次进样前都分别用0. 1m o l/L N a O H冲洗3 m in，水洗1m in，再用缓冲溶液冲洗2 m in。
进样方式选择：毛细管电泳的进样方式对分离效率和重复性有重要影响。压力进样和电动进样为最常见的2种进样方式，电动进样对黏度较大的生化样品比较适合，但测量重复性较差，且可能因各组分扩散系数的差异而导致迁移速率的改变，三黄片中大黄有效成分的提取物相对生化样品黏度较低，且需注重重复性，因此选择压力进样作为进样方式。进样压力0. 5 p s i，进样时间0. 5 s。
缓冲溶液优化：大黄素和大黄酚的化学结构相似，电荷差异小，且大黄提取中成分较多，采用区带电泳分离模式(C Z E)较难实现3种目标组分的完全分离。因 此，本试验中通过加人在缓冲体系中加人低浓度H P- P-C D，在传统的C Z E电泳模式下引人胶束电谱模式，增加不同组分在分配系数上的差异。当HP - p -⑶浓度达到40 mmol/L时，实现完全分离，高效毛细管电泳图见图1。
U/m V
t/m
tsf
U/m V
20 000:
10 000:
o-
■■■.........................................../min
0 10 20 30 40 50
B
1.大黄素
2.大黄酚
A. CZE模式下
B. HP - p - CD修饰后CZE模式
图1大黄混合对照品的高效毛细管电泳图
2
2.4 方法学考察
专属性试验：依照2015年版《中国药典(一部牘中 三黄片的制法[4]，除不加人大黄药材，其余制法步骤与 三黄片制法一致，并将制作的样品按2.2项下方法配制 供试品溶液，与三黄片实际样品在相同条件下进行毛细 管电泳分析。结果三黄片中辅料与其他成分对大黄有效 成分无干扰(见图2,，方法专属性良好。
U/m V
40 000
20 000-
0-^-----------»--------------
0 10 20 30 40 50
A
/ min
U/m V
0 10 20 30 40 50
B
1.大黄素
2.大黄酚
A.三黄片辅料
B.三黄片
图2 三黄片辅料和三黄片高效毛细管电泳图
检出限与定量限试验：分别取2. 2项下对照品溶液，按拟订电泳条件测定检出限和定量限。结果大黄素和大 黄酚的检出限分别为0. 78 p g/m L和0. 51 p g/m L，定量 限分别为 2. 0 |xg/m L和 2. 5 |x g/m L。
重复性试验：精密量取2. 2项下对照品溶液适量，
横断面
11
.硏究.
Drug Research China Pharmaceuticals 2018年3月5日第27卷第5期Vol. 27, No. 5, March5, 2018
按拟订电泳条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果大黄素和大黄酚的分别为1. 76%和1. 53%牗=6)，
表明仪器精密度良好。
线性关系考察：分别精密吸取2. 2项下大黄素和大黄酚对照品溶液，以加无水乙醇-乙酸乙酯(2 : 1)的混合溶液为稀释液，配置成质量浓度分别为1,5,10,15,20 阳/m L 的大黄素对照品溶液和质量浓度分别为2. 5 p g/m L, 12. 5 |x//m L，312. 5 |x//m L，1.56 //L，7. 8 //L 的大黄酚对照品溶液。并分别以拟订电泳条件进行电泳分析检测，以质量浓度为横坐标（Z)、峰面积为纵坐标（进行回归分析，得回归方程，大黄素F= 0. 078 11Z-0. 038 1 牗=0. 995 1)大黄酚r= 0. 082 11Z-0. 042 1牗= 0. 995 7)。结果表明，大黄素和大黄酚的质量浓度线性范围分别为2. 0 ~ 18. 5 p g/m L，2. 50 ~ 1. 56 x103|x g/m L。
加样回收试验：取样品（批号为120612201603)粉末约0. 26 / ，精密称定，共3份，分别置5个锥形瓶中，按 2. 2项下方法制备供试品溶液，按拟订电泳条件检测并记录每份样品的电泳谱图，再在每份供试品中加人等量的大黄素和大黄酚对照品各0. 3 m/，再次测定其含量，分别计算大黄素和大黄酚的平均回收率。结果见表1结果显示该方法单组分回收率较好，多组分R S O偏高，分析可能是由于大黄提取物成分较多，且本方法是同时考察两组分在电泳中的含量，目标组分间存在化学性质差异，导致检测效率不一致。
2.5 样品含量测定
分别取不同批次三黄片样品粉末约0. 26 /，精密称定，按 2. 2项下方法制备供试品溶液，按拟订电泳
法测定含量。结果见表2。
表1加样回收试验结果（^ = 3)
样品含量(m/)加入量（m/)测得量（m/)回收率（％)f(%)RSD(%)
A B A B A B A B A B A B
0.643 20.78930.30.30.92311.073 293.3094.63
0.64270.79010.30.30.9214 1.083192.9097.6793.5397.260.83 2.52 0.64330.78990.30.30.92650.088 394.4099.47
注：A为大黄素，B为大黄酴。下表同。
表2 3批样品中大黄素和大黄酚含量测定结果（^ = 3)
批号
含量(m/)总含量RSD A B(m/)(%)
1206122016030.69920.787 3 1.486 5
206 220 6050.6980.791 1 1.48921.75 206 220 6070.68490.799 1 1.4840
3 讨论
三黄片中大黄有效成分主要为大黄素和大黄酚，两种组分化学结构相似，带电差异小，传统区带电泳(C Z E)模式分离效果较差。本试验中采用H P-p-C D 修饰毛细管区带电泳的方式分离检测，由于环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，具有一定的疏水性，在传统缓冲体系中增加了一定的多相特性，待分离组分在具有环糊精的缓冲体系中，由于不同的疏水性而呈现出不同的分配系数，导致组分在毛细管电泳中表明，不仅受电渗流的影响，同时也受到分配谱的影响，有利于组分的完全分离。
方法学考察发现，含量测定的R S O偏高，分析原因，该方法是建立在保证三黄片中大黄有效成分的分离度之上的，在实现各指标组分的完全分离情况下，一定程度上影响了含量测定的准确度，导致结果R S O偏高，后期可在方法优化上进一步改进。
本试验中并未对缓冲溶液p H进行系统优化，因为 大黄素和大黄酚均为弱酸性，且其带电荷特性相近，在 保证电渗流的情况下，p H对大黄素和大黄酚的分离并非主要影响因素。参考文献：
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(收稿日期=2017 -11-28)
12
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