克罗诺杆菌的随机多态性扩增DNA（RAPD）基因分型研究 杨海荣;赵贵明;王娉;赵勇胜;袁飞;胡玥;陈颖
【摘 要】研究了克罗诺杆菌标准菌株和样品中分离菌株的分子特征,为克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源提供一种有效手段。采用随机引物扩增多态性DNA分析对38株菌株进行基因分型。筛选出1条随机引物,每一菌株可扩增出1～7条DNA片段,片段在400-3500bp,可将8株标准菌株的种间区分开来。以相似性50%为标准,38株克罗诺杆菌按照其遗传差异可以分为8个基因型类。所建立的RAPD技术可用于克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源研究。%To provide an effective means for species identification and epidemiological tracing for Cronobacter spp. strains by studying molecular characteristic of reference strains and strains isolated from samples, 38 Cronobacter spp. strains were identified by genotyping test-Genomic DNA was extracted by methods of Randomly Amplified Poly- morphic DNA analysis （RAPD）. One effective primer was selected with which each strain could be amplified 1 to 7 DNA fragments of 400 -2 000bp. 8 reference strains were identified into separate species groups. Similar to 50% for the standard, 38 strains could be classified in to 8 genotyping groups by genetic differences. RAPD method in this study can be applied to species identification and epidemiological tracing for Cronobacter spp. strains.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)004
空间数据库【总页数】5页(P6-10)
【关键词】克罗诺杆菌;随机多态性扩增DNA（RAPD）;基因分型
【作 者】杨海荣;赵贵明;王娉;赵勇胜;袁飞;胡玥;陈颖
【作者单位】中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123
【正文语种】中 文
【中图分类】S662.1
阪崎肠杆菌(Enterbacter sakazakii)曾经一直被称为产黄素的阴沟肠杆菌，直到1980年，Faemer等根据DNA-DNA杂交、生化反应、产素的不同等将该菌从阴沟肠杆菌中分离出来，更名为阪崎肠杆菌。2008年，Iversen等根据16S rRNA基因序列、核糖体分型、扩增片段长度多态性等对阪崎肠杆菌重新进行系统学分类，将该菌划分为一个新的属，即克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)[1-3］。近年来，克罗诺杆菌与婴幼儿配方粉污染及由此引发的婴幼儿脑膜炎、坏死性结肠炎、菌血症等而备受关注[4-5］。文献报道，我国不同地区婴幼儿配方奶粉及婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染率为6%左右[6］，安徽阜阳劣质婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的污染率更是高达12.6%[7］。快速而准确地对克罗诺杆菌进行鉴定和分型，不仅能为该病的诊断和提供依据，而且对该病的分子流行病学调查具有重要的意义。
随机多态性扩增DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术是一种简便、可行、灵敏的遗传标记技术，目前广泛应用于微生物的分子分型、物种亲缘关系的确定及分子流行病学的调查等领域[8-10］。本研究应用RAPD技术对8株克罗诺杆菌的标准菌株DN
A进行扩增，从中筛选出可以区分克罗诺杆菌不同种属的特异性引物。通过对30株食品分离株进行RAPD分型，表明本研究建立的RAPD分型方法可用于克罗诺杆菌的分型和溯源。可为监测克罗诺杆菌提供参考。
本实验共选取38株克罗诺杆菌，其中30株来自中国检验检疫科学研究院食品安全微生物菌种保藏管理中心(IQCC);2株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC);5株购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ);1株购自英国国家标准菌库。实验菌株的编号、名称和来源见表1。
脑心浸液肉汤(BHI)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，购自北京陆桥技术有限责任公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，购自天根生化科技(北京)有限公司;RAPD随机引物，购自北京赛百盛基因技术有限公司;dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR buffer、DNA Maker，购自 TAKARA 公司;毛细管卡夹，购自QIAGEN公司。
离心机(5804R型，德国Eppendorf公司)，核酸蛋白分析仪(DU640，Beckman)，PCR 仪(Eppendorf，5333)，凝胶成像仪(Gene Genius)，全自动毛细管电泳仪(QIAXCEL，QIAGEN)，核酸蛋白分析仪(DU640，德国 Beckman公司)。
天津市建筑业协会
实验菌株经37℃ 24 h纯培养后取2 mL菌液于Epperdorf管中，用天根基因组提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作按照说明书进行。测定基因组DNA 的浓度，调整浓度至 20 μg/μL，-20℃ 保存备用。
用20条随机引物对8株克罗诺杆菌标准菌株DNA进行PCR扩增，每条引物做3次平行试验，经过毛细管电泳仪电泳观察，得到不同的指纹图谱，筛选出重复性和稳定性好的引物。
RAPD扩增采用25 μL的反应体系:PCR buffer 2.5 μL;dNTP2μL;随机引物1.3 μL;TaqDNA聚合酶0.2 μL;DNA模板5 μL;用无菌水补至总体积为25 μL。RAPD扩增反应程序为:94℃预变性10 min;94℃1 min，37℃1 min，72℃2 min，共运行45个循环;72℃5 min;4℃保存。
铣床夹具取10 μL RAPD扩增产物，按照全自动毛细管电泳仪的使用说明，进行DNA分析检测，得到不同的指纹图谱，拍照保存。
应用BioNumerics软件对RAPD条带进行聚类分析，用N-J法构建系统进化树，并进行Bootstrap值分析。RAPD方法的分辨力(discrimination index，D.I.)按照以下公式计算[11］:
通过对20条随机引物的筛选，其中S09(TGGAGAGCAG)引物对8株标准菌株模板DNA进行扩增后，指纹图谱显示多态性(如图1所示)，而且重复性和稳定性好，确定为本实验菌株基因分型的引物。
对38株克罗诺杆菌(包括8株标准菌株)进行随机多态性扩增，结果表明，所有菌株基因组DNA经扩增后均产生了清晰、可分辨的谱带，扩增产物在1-7条条带之间，片段分子质量在400-3500bp之间，具有多种带型组成。
38株克罗诺杆菌可分成37个不同的RAPD带型，该方法的分辨力D.I.为0.999。利用BioNumerics软件对38株克罗诺杆菌RAPD电泳结果进行聚类分析，建立了亲缘关系的树状图。由图2可知，8株标准菌株分处于不同的分支类上，可将该8株菌株区分开来，且所有的菌株可以分成4个大的类。以相似性50%为标准(竖线所示)，38株克罗诺杆菌按照其遗传差异可以分为8个基因型类。其中I型7株(18.42%)，II型5株(13.06%)，III型13株(34.21%)，IV型4株(10.53%)，V型3株(7.89%)，VI型1株(2.63%)，VII型2株(5.26%)，VIII型3株(7.89%)。III型菌株占到了总菌株的34.21%，是食品样品中分离的优势菌株，I型和II型菌株中分离菌株均含有大小约1300bp和750bp左右的2个片段，且具有高度相似性，推uuv
EGERIA测这些菌株可能是来源于同一个亲本的不同克隆。本实验中分离的克罗诺杆菌大都是一个带型对应一个菌株，这可能与菌株收集范围广泛，分离地点较分散有关。
目前，对克罗诺杆菌不同种的划分主要以生化表型分析和16S rRNA，DNA-DNA杂交试验等遗传特征分析为主。传统的表型方法具有一定的局限性，不能有效区分不同地区的克罗诺杆菌流行菌株，其分辨力较基因分型差。基因分型方法如多位点序列分型，脉冲场凝胶电泳等目前主要用于克罗诺杆菌的分型研究，还没有种间鉴别的相关报道。RAPD技术在种属特异性鉴定及基因水平种属内分型及亚型分型中已得到广泛应用。利用RAPD技术对克罗诺杆菌进行基因分型既可以为该菌的鉴定提供切实可靠地方法，又可为分子流行病学调查提供有效地手段。RAPD技术采用随机引物进行分型。理论上，同种型别的菌株应该具备特异稳定的指纹图谱，因此可用RAPD技术来鉴别不同种属、不同型别的菌株。分属于克罗诺杆菌不同种的8株标准菌株可被分成不同的带型，表明RAPD技术对于鉴别不同种的克罗诺杆菌是完全可行的。
本研究用随机引物对38株克罗诺杆菌进行RAPD分型研究，最终筛选出1条多态性和稳定性较好的随机引物，并初步验证了其在食品分离株中的分型能力，建立了克罗诺杆菌的RAPD基因分型方法，可为食品和环境中该菌的分型和溯源提供参考。
[1]Iversen C，Lehner A，Mullane N，et al.Identification of‘Cronobacter’spp.(Enterobacter sakazakii)[J］.J Clin Microbiol，2007，45(11):3814-3816.
抗体效价
[2]Iversen C，Lehner A，Mullane N，et al.The taxonomy of Enterobacter sakazakii:proposal of a new genus v.and descriptions of Cronobacter v.Cronobactersakazakiisubsp.sakazakii，v.，Cronobacter sakazakii subsp.v.，Cronobacter v.，Cronobacter v.，Cronobacter v.and Cronobacter genomospecies[J］.BMC Evolutionary Biology，2007，7(1):64.
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