第36卷第6期
2018年11月
食品科学技术学报
Journal of Food Science and Technology
Vol.36No.6
Nov.2018 doi:10.3969/j.issn.2095⁃6002.2018.06.009文章编号:2095⁃6002(2018)06⁃0058⁃08
引用格式：刘佳秀，查振兴，于文溪，等.海洋源乳酸菌在黄花鱼肉保鲜中的应用研究[J].食品科学技术学报,2018,36(6): 58-65. LIU Jiaxiu,CHA Zhenxin,YU Wenxi,et al.Application of lactic acid bacteria from marine fish as biopreservative in yellow croaker preservation[J].Journal of Food Science and Technology,2018,36(6):58-65.
一五计划海洋源乳酸菌在黄花鱼肉保鲜中的应用研究
刘佳秀, 查振兴, 于文溪, 董 雪, 王 勋, 妥彦峰*
(大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034)
摘 要：研究了分离自海洋鱼类的乳酸菌对黄花鱼肉的保鲜作用，通过牛津杯法抑菌实验测定海洋鱼类来源乳酸菌对7株指示菌Listeria monocytogenes㊁Salmonella enterica㊁Staphylococcus aureus㊁Vibrio parahaemolyticus㊁Serratia marcescens㊁Acinetobacter spp.㊁Pseudomonas spp.的抑制作用，发现Lactobacillus plantarum Y12㊁L.plantarum Y3⁃1㊁L.plantarum Y42抑制指示菌生长的效果最好；接种菌株Y12㊁Y3⁃1㊁Y42的鱼肉在4℃保藏8d，其挥发性盐基氮(TVBN)含量与未接菌鱼肉TVBN含量之间无显著差异(p>0.05)，证明菌株Y12㊁Y3⁃1㊁Y42对鱼肉无致腐作用㊂将Pseudomonas spp.
单独或L.plantarum Y12与Pseudomonas spp.混合接种于灭菌鱼汁，发现第5天混合培养鱼汁TVBN值((24.55±1.00)mg/100g)显著低于(p<0.05)单独接种鱼汁的TVBN值((29.09±0.60)mg/100g)；混合培养鱼汁的pH值低于单独接种鱼汁的pH值，而感官得分高于单独接种鱼 汁感官得分㊂新鲜黄花鱼肉中接种Pseudomonas spp.或混合接种L.plantarum Y12与Pseudomonas spp.，保藏第5天，混合接种的鱼肉TVBN值((27.30±1.97)mg/100g)显著低于(p<0.05)单独接种鱼肉的TVBN值((34.30±0.01)mg/100g)，并且混合培养的感官评分高于单独培养的鱼肉㊂结果表明，海洋鱼类来源的L.plantarum Y12具有抑制鱼肉中腐败菌生长㊁防止鱼肉腐败的功能㊂
关键词：乳酸菌；生物保鲜；鱼汁；鱼肉；抑菌实验
中图分类号:TS201.3 文献标志码:A
收稿日期:20180613
基金项目：大连工业大学大学生创新创业项目(201710152066)㊂
作者简介：刘佳秀，女，硕士研究生，研究方向为益生菌与蛋白质功能特性;
*妥彦峰，男，副教授，博士，主要从事益生菌功能特性方面的研究，通信作者㊂
中国水产品资源丰富,2016年全国水产品总产
量已达6901.25万t[1]㊂水产品中含有高蛋白，以
及能够减少心血管疾病的不饱和脂肪酸，除此之外
还含有人体所需重要矿物质以及维生素，因此深受
消费者的青睐[2]㊂然而高含量的小分子含氮化合
物，以及适合病原菌和腐败菌生长的中性pH值环
境，使水产品成为一种极易腐败的食品，腐败后的水
产品质量下降，造成经济损失[3]㊂
在鱼类运输及销售过程中必须有一定的保鲜手
段，我国当下主要使用化学和物理保藏方式，其中化
学，如亚硝酸盐，对人体有一定的危害[4-5]；物理保鲜中
冷冻在解冻后会造成汁液外渗，而高温处理会造成食
品感官缺陷[6]㊂天然㊁安全的保鲜方式受到消费者欢
迎㊂乳酸菌广泛存在于发酵食品以及人和动物的肠道
内，是一种普遍认为安全的微生物[7]㊂而且乳酸菌具
有广泛的抑菌谱，利用乳酸菌防止食品中腐败菌生长
具有悠久的历史和优良的保藏效果[5,8]㊂利用乳酸菌
作用生物保鲜剂对鱼肉进行保鲜也受到了广泛的关
注[7,9]，但缺乏系统性㊂乳酸菌应用于水产品的保鲜,
其对鱼肉中常见有害菌生长的抑制作用㊁对鱼肉的潜85
在致腐性是作为筛选鱼肉生物保鲜剂的前提[10]㊂文章研究了大连市益生菌功能特性研究重点实验室保藏的海洋鱼类来源乳酸菌对鱼肉中常见有害菌的抑菌特性及其对鱼肉的潜在致腐性，筛选出3株高抑菌性的乳酸菌，并研究了乳酸菌防止有害菌腐败鱼肉的潜在特性㊂
1 实验部分
1.1 材料与方法
1.1.1 材料与试剂
黄花鱼，大连市乐购超市；阿拉伯胶(分析纯)，上海源叶生物试剂有限公司；硼酸㊁碳酸钾(分析纯)，天津大茂化工厂;LB㊁MRS培养基，北京奥博星生物技术有限公司㊂
1.1.2 仪器与设备
S210-K型SEVENCOMPACT pH计,Mettler To⁃ledo仪器有限公司;Multiskan GO型酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司;FS-1C-50型冷冻离心机，德国HERMLE Labortechnik GmbH公司㊂
1.1.3 实验菌株
实验中使用乳酸菌(LABs)以及指示菌如表1㊂所用乳酸菌均由大连市益生菌功能特性研究重点实验室分离自海洋鱼类，并经过16S rRNA序列分析鉴定㊂
表1 乳酸菌和指示菌信息以及培养条件
Tab.1 Information and culture conditions of LABs and indicator bacteria
种名编号及来源培养条件
乳酸菌
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei Y12/本实验室分离保藏
Y37/本实验室分离保藏
Y42/本实验室分离保藏
Y44/本实验室分离保藏
Y3⁃1/本实验室分离保藏
Y4/本实验室分离保藏
MRS培养基37℃培养18h,
活化2代，待用
财务信息化致病菌Listeria monocytogenes CCTCC AB209106/本实验室购买保藏
Salmonella enterica CCTCC AB99003/本实验室购买保藏
Staphylococcus aureus ATCC25923/本实验室购买保藏
Vibrio parahaemolyticus ATCC33847/本实验室购买保藏
LB培养基37℃培养18h,
活化2代，待用
腐败菌
Serratia marcescens ATCC14041/本实验室购买保藏
Pseudomonas spp.H6/大连工业大学食品学院侯红漫教授课题组分离保藏
Aeromonas hydrophila ATCC51307/本实验室购买保藏
LB培养基37℃培养18h,
活化2代，待用
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌抑菌实验
采用平板扩散法测定备选乳酸菌对指示菌生长的抑制作用㊂乳酸菌处理：将培养至第2代的乳酸菌OD600值调至1.0左右，按照2%接种量进行接种,100μL菌悬液接种于5mL MRS液体培养基中,
37℃培养18h后，将乳酸菌培养液离心(8000 r/min,10min,4℃)得上清液(CFS)，备用㊂
指示菌处理：将传代3代的致病菌OD600值调节至0.25左右，按照2%接种量，将致病菌接入分装好的20mL LB固体培养基中，摇匀㊁备用㊂
培养基制备：在平板底部铺上15mL左右的素琼脂(2g琼脂/100mL去离子水)，晾干；放置牛津杯，每个平板中放置4个；将含有指示菌的LB固体培养基倾注到平板中，晾干1h；每个孔接入200μL 乳酸菌CFS,37℃培养2d，使用游标卡尺测量抑菌圈大小；所有实验做3次平行㊂
1.2.2 菌悬液及鱼块的制备方法
乳酸菌菌悬液制备：将4℃保藏的乳酸菌经MRS肉汤活化2代，梯度稀释进行菌落计数，根据平板计数结果，使用灭菌生理盐水将活化好的乳酸菌进行稀释，获得不同浓度的乳酸菌菌悬液㊂黄花鱼鱼块制
备：将从大连市超市购买的黄花鱼去骨，去尾，去除内脏，用无菌蒸馏水进行清洗㊂将鱼肉切割成10g左右的生鱼片，将各个样品在其相对应的乳酸菌菌悬液中浸渍30min，取出沥干3~5min，放入经过高温灭菌的培养皿，外部使用体积分数75%酒精灭菌保鲜膜覆盖，放入4℃的冰箱储存㊂实验过程中器具事先用75%酒精进行消毒㊂
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第36卷第6期 刘佳秀等：海洋源乳酸菌在黄花鱼肉保鲜中的应用研究
1.2.3 灭菌鱼汁的制备方法
根据Leroi等[9]的方法略有修改㊂取处理好的鱼块，使用打浆机打成泥状；以m(蒸馏水)∶m(鱼泥)=2∶1混匀，将混合物煮沸2min；使用四层纱布进行过滤，得到滤液；鱼汁滤液在105℃下灭菌10
min，在-20℃下储存，使用前4℃下解冻使用㊂1.2.4 pH值测定方法
pH值使用pH计测定㊂
1.2.5 挥发性盐基氮测定方法
根据GB5009.228 2016‘食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定“[10]中描述的微量扩散法进行挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVBN)测定㊂
1.2.6 鱼汁感官评价方法
根据Macé等[11]的方法略有修改：在实验室选6名具有食品感官评定专业知识的学生，经过培训后，作为感官评定人员对接种乳酸菌的鱼汁进行感官评定㊂所有的鱼汁样品保存在灭菌试管中，保证其原有的风味物质㊂每次评定每种乳酸菌平行实验3组，进行随机标号，随机分配给6名评定人员进行评分，分数10~1分不等㊂未接入乳酸菌的鱼汁作为空白对照㊂腐败程度:Ⅰ未腐败(10~9)㊁Ⅱ略微腐败(8~7)㊁Ⅲ中度腐败(6~5)㊁Ⅳ严重腐败(4~ 1)，其中6为不可接受限㊂
1.2.7 鱼肉感官评价方法
鱼肉感官评价根据黄晓春等[12]略有修改㊂黄 花鱼肉以泽㊁气味㊁组织形态和肌肉弹性为检验项目，分值分别为10~1分制，感官接受程度越高得分越高，以生鱼片5项得分的平均值为鱼肉感官评定结果，其中6分作为感官不可接受限㊂
1.2.8 数据处理及绘图
使用SPSS22.0进行数据处理,Origin Pro8.5进行绘图㊂
2 结果与分析
2.1 灭菌鱼汁菌落数量
灭菌鱼汁在计数平板上，达到无菌的状态，保证添加的菌种只有L.plantarum Y12和Pseudomonas
spp.，排除干扰，防止了其他杂菌的污染㊂
2.2 抑菌实验结果
研究所用乳酸菌对7种鱼肉中常见有害菌生长具有不同程度的抑制作用，结果见表2㊂其中对致病菌V.parahaemolyticus有明显的抑制效果；对腐败菌A.hydrophila的抑制效果最好，其次为S.marces⁃cens，而对Pseudomonas spp.的抑制作用不如其他2株腐败菌明显㊂经测定不同乳酸菌MRS发酵液pH 值均为3.85左右，因此乳酸菌主要通过有机酸对有害菌生长产生抑制作用㊂使用SPSS22.0进行主成分分析(PCA)，得分见表2，其中主成分得分最高的为L.plantarum Y12，其次为L.plantarum Y42以及L.plantarum Y3⁃1㊂
表2 平板扩散法测定LABs的抑菌能力Tab.2 Antimicrobial activity of LABs determined by well⁃diffusion assay
d(抑菌圈)/ mm 上清液
pH V.togenes S.ica
Pseudomonas
spp.A.hydrophila S.marcescens PCA得分
Y43.80++++++++++++++0.1756 Y123.85+++++++++++++++++++1.7115 Y373.89+++++++++++++-0.8474 Y423.89++++++++++++++++0.8453 Y443.89+++++++++++++++-1.1220 Y3⁃13.83+++++++++++++++++0.6117 +”抑菌圈直径≤15mm, ++”抑菌圈直径在15~17.5mm, +++”抑菌圈直径在17.5~20mm㊂
鱼类㊁贝类等水产品表面有丰富的微生物落，其中含有危害食品安全的致病菌以及使食品腐败变质的腐败菌，尤其是水产品中特定腐败菌[13]㊂Arena等[14]研究发现79株不同来源的植物乳杆菌发酵上清液对L.monocytogenes以及S.aureus有很好的抑制作用㊂季红等[15]对10株L.plantarum的抑菌性能进行研究，其中L.plantarum ST⁃III所产的类细菌素物质能够抑制S.enterica以及S.aureus，并且在pH值5.0~6.5最为明显㊂细菌素是乳酸菌产生的一种抑菌大分子，但乳酸菌产生的细菌素类
06食品科学技术学报 2018年11月
物质通常在低pH 值条件下发挥抑菌作用[4,16]㊂文中6株从海鱼中分离的乳酸菌有广泛的抑菌谱，能
够抑制7种鱼肉中常见的有害菌，但对不同菌株的抑制作用有所差异，可能与乳酸菌菌株所产的抑菌物质不同有关系㊂
2.3 乳酸菌对新鲜鱼肉致腐实验结果
将初筛获得抑菌性较好的菌株L .plantarum
Y12㊁Y42㊁Y3⁃1，制备浓度为107CFU /mL 的菌悬液，将黄花鱼块浸渍于菌悬液10min，于4℃保藏8d，测定保藏期间鱼肉pH 值及挥发性盐基氮含量的变化，结果如图1㊁图2㊂
根据图1和图2，接入乳酸菌的鱼肉pH 值较未接乳酸菌的稍低，变化不显著(p >0.05)㊂在保藏第3天时,ω(TVBN)小于10mg /100g，属于一级鲜肉；第6天，未接菌的鱼肉ω(TVBN)高达(18.45±0.24)mg /100g，接入L .plantarum Y12㊁Y3⁃1㊁Y42的鱼肉ω(TVBN)分别为(12.39±0.10)㊁(15.07±
0.25)㊁(15.15±0.12)mg /100g，说明乳酸菌没有腐败鱼肉，反而能够抑制鱼肉腐败变质㊂在第7天时，接菌和未接菌的鱼肉的ω(TVBN)都超过国家标准(30mg /100g)
[17]
，鱼肉已经开始腐败㊂在第8天
时，其中浸渍L .plantarum Y12菌悬液的鱼肉ω
(TVBN)为(38.91±0.20)mg /100g，低于空白组(49.87±0.40)mg /100g(p <0.05)㊂在整个保藏期内L .plantarum Y12不腐败鱼肉，并且展现了良好的保鲜能力，因此选择L .plantarum Y12进行后续实验
㊂
图1 乳酸菌处理鱼肉中pH 值变化
Fig.1 pH evolution in fresh fish meat juice at 4℃
标记免疫分析与临床
邵力平近年来有学者发现，在食品腐败的后期，乳酸菌是其中主要的腐败菌，尤其是气调包装后期㊂判断乳酸菌是否能够应用于食品中，应该考虑其是否对食品有一定的致腐性[7,18]，因此在保鲜实验之前，必
须探究其是否对鱼肉本身具有致腐性㊂
Wiernasz
图2 乳酸菌处理鱼块中TVBN 值变化Fig.2 Changes of TVBN in fresh fish
meat juice at 4℃
等[19]在鱼汁中观察了35株乳酸菌的致腐性，发现乳酸菌对鱼肉没有致腐作用㊂Macé等[20]在鲑鱼中分离出的Lactococcus piscium 未造成鲑鱼腐败㊂乳酸菌存在于鱼肉中，在自身的生长繁殖过程中，产生乳酸等酸性物质,pH 值的测定是乳酸菌应用于保鲜中一个指标㊂很多研究表明，乳酸菌能够有效地延长食品的保质期，但是却造成食品的酸化[21-22]㊂本实验整个保藏过程中和空白相比,3株乳酸菌没有酸化鱼肉的趋势(p >0.05)，也未引起鱼肉腐败㊂
2.4 乳酸菌对灭菌鱼汁保鲜实验结果
分别制备4组新鲜的鱼汁，乳酸菌组鱼汁中接
种体积分数2%㊁浓度为107CFU /mL 的L .planta⁃
rum Y12菌悬液;Pseudomonas spp.组接种体积分数
2%㊁浓度为105CFU /mL 的Pseudomonas spp.菌悬液；混合培养组分别接种体积分数2%，浓度分别为107㊁105CFU /mL 的Y12菌悬液以及Pseudomonas spp.菌悬液；空白组不接入任何微生物㊂各组鱼汁于8℃下保藏6d，保藏期内鱼汁pH 值和TVBN 值变化分别见图3㊁图4㊂不要告诉妈妈
研究乳酸菌的保鲜性能，灭菌的食品是一种理想的模型㊂根据图3，未接入微生物的对照组鱼汁由于无菌条件，在保藏的6d 里pH 值始终处于6.9左右，且没有变化(p >0.05)㊂单独接种L .planta⁃rum Y12的鱼汁全程pH 值保持6.6左右，较第0天pH 值6.9，有显著下降(p <0.05)㊂腐败菌单独培养的鱼汁pH 值和空白相比有显著下降(p <0.05)㊂
乳酸菌和腐败菌混合培养的鱼汁整个保存过程中pH 值先下降㊁再逐步上升，可能由于前期乳酸菌生长产酸pH 值降低，后期腐败菌繁殖，鱼肉中的蛋白质降解产生氨类物质，导致pH 值上升㊂结合感官评定(见表3)，单独接种L .plantarum Y12的鱼汁pH 值降低，但没有造成鱼汁不良感官变化，该结论
1
6第36卷第6期 刘佳秀等：海洋源乳酸菌在黄花鱼肉保鲜中的应用研究
和Fall 等[23]的研究相似
㊂
图3 8℃下灭菌鱼汁中pH 值随时间的变化
Fig.3 pH evolution in sterilized fish juice at 8℃
根据图4，第2天和第3天的混合培养的鱼汁中由于L .plantarum Y12产生有机酸等抑菌物质,ω(TVBN)分别为(10.36±1.00)mg /100g 和(10.79±
1.61)mg /100g;Pseudomonas spp.单独培养鱼汁中，第2天和第3天的ω(TVBN)分别为(15.33±0.00)mg /100g 和(17.03±0.40)mg /100g，均显著高于混合培养组(p <0.05)㊂第5天,Pseudomonas spp.组ω(TVBN)为(29.09±0.60)mg /100g，和国家鲜肉标准30mg /100g 没有显著差异(p >0.05)；混合培养组ω(TVBN)为(24.55±1.00)mg /100g，显著低于国家鲜肉标准30mg /100g (p <0.05)㊂唐文静等[24]在对冷藏海鲈鱼鱼块的保鲜实验中发现乳酸菌能够明显抑制鲈鱼块中腐败菌的生长，降低了TVBN 含量，和本文结果相似㊂根据图3和图4，鱼汁在保藏过程中，和腐败菌单独培养相比，混合培养的pH 值降低,TVBN 含量增加较慢，可能由于
pH 值的降低抑制了Pseudomonas spp.的生长繁殖，从而降低了腐败程度
㊂
图4 8℃下鱼汁中TVBN 值随时间的变化
Fig.4 Changes of TVBN in sterilized fish juice at 8℃
将L.plantarum Y12及Pseudomonas spp.接种于灭菌鱼汁，进行感官评定，结果见表3㊂在保存过程中，对照组鱼汁在6d 保藏过程中鱼腥味都非常明显，但是随着时间的延长鱼汁的味道变淡；和对照组不同的是，接种Y12的鱼汁会有酸味，结合图3，鱼汁的pH 值有一定下降，可能是由于L.plantarum Y12产酸造成这种酸味，这种酸度是被评价人员接受的㊂接种Pseudomonas spp.的鱼汁在第1天时鱼腥味和对照没有区别，第2天开始鱼腥味仍然明显，但是从第3天开始，鱼汁逐渐产生让人无法接受的臭味，在保藏的最后一天，味道刺鼻已经无法进行感官评定；混合培养的鱼汁在前3d 感官评价分数较高，异味不明显，第4天时候才出现异味，原因可能是后期腐败菌生长,L.plantarum Y12抑制能力逐渐减弱，感官评价分数也随之降低㊂
表3 灭菌鱼汁在8℃条件下保藏6d 的感官评价结果
Tab.3 Sensory evaluation of sterilized fish juice preserved at 8℃for 6days
t /d 评价得分/感官描述
对照
L .plantarum Y12Pseudomonas spp.混合培养
110/未腐败，鱼腥味10/未腐败，鱼腥味9/未腐败，鱼腥味㊁无明显臭味9/未腐败，鱼腥味210/未腐败，
鱼腥味10/未腐败，鱼腥味7/轻度腐败，略臭
9/未腐败，轻微鱼腥味310/未腐败，鱼腥味9/未腐败，鱼腥味较重，略微
酸，不影响感官7/轻度腐败，较前2d 臭味明显8/轻度腐败，略臭49/未腐败，鱼腥味较重9/未腐败，鱼腥味变淡，略微酸，不影响感官5/中度腐败，同第3天，没有明显变化
7/轻度腐败，略臭
59/未腐败，鱼腥味较重9/未腐败，鱼腥味变淡，略微
酸，不影响感官2/重度腐败，刺鼻臭味5/中度腐败，较第4天加重6
9/未腐败，鱼腥味变淡
9/未腐败，鱼腥味变淡，略微酸，不影响感官
1/重度腐败，刺鼻臭味，无法进
行感官评定
3/重度腐败，刺鼻臭味
26食品科学技术学报 2018年11月
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