自从1879年梅契尼柯夫最先从奥地利金龟上分离到金龟子绿僵菌以来，已有100多年的历史。近 20年来，随着巴西和澳大利亚广泛使用金龟子绿僵
菌防治甘蔗和牧草害虫取得较大进展，以及在非洲用黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride ）防治蝗虫实验的初步成功，借助于分子生物学技术和基因工程技术的大规模使用，人们在关注绿僵菌的同时，对它的研究领域也在不断深入。 1绿僵菌属的系统分类现状玉兔号在月面探测中有哪些科学发现
自Sorokin 于1883年建立绿僵菌属Metarhizium 以来，先后发表10余个种，由于不同作者采用的标准不一致，故分类状况比较混乱，目前国际上广泛接受的分类观点是Tulloch 建立的，他将绿僵菌属定为2个种，包括金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种［1］。近年来，国内相继发表多个新种，但由于对其特征描述不尽完善
收稿日期：2009－04－20基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD30B03）；广西科学研究与技术开发计划项目（桂科基0778006－8）；广西农业科
学院科技发展基金项目［2006004（Z ）］
作者简介：丁苗苗（1984－），女，安徽淮南人，硕士研究生，主要从事农业昆虫与害虫防治研究工作。
绿僵菌的研究现状及进展
丁苗苗1，于永浩2，3，曾
涛2
（1广西大学农学院，南宁
530005；2广西农业科学院植物保护研究所，南宁
沸腾都市530007；
3华南农业大学资源环境学院昆虫学系，广州
510640）
摘要：介绍了近年来国内外在绿僵菌的分类、分离与鉴定方法、生物学特性和应用等方面的研究进展，指出绿僵菌在分子系统学研究、
基因遗传育种、剂型的改进和扩大防治对象上已取得较大的进展，但与Bt 等杀虫微生物的研究相比还有较大差距。提出应加强对高毒力绿僵菌菌株的筛选；在防治害虫时尽量减少湿度、紫外线以及土壤微生物和土壤物理、化学性质等对绿僵菌防效的影响，以提高绿僵菌对靶标害虫的防治效果。
关键词：绿僵菌；分类；分离鉴定；生物学特性；应用；研究进展中图分类号：S476+.12
文献标识码：A
文章编号：1002－8161（2009）11－1443－05
Current situation and development research on
Metarhizium spp．
DING Miao－miao 1，YU Yong－hao 2，3，ZENG Tao 3
（1Agricultural College ，Guangxi University ，Nanning 530005，China ；2Plant Protection Institute ，Guangxi Academy of
Agricultural Sciences ，Nanning 530007，China ；3Department of Entomology ，College of Resources and Environment ，
South China Agricultural University ，Guangzhou ，Guangdong 510640，China ）Abstract ：The present study summarizes the researches on classification ，separation and identification method ，bio-logical characteristics and applications of Metarhizium spp．，at China and abroad during recent years．Recently ，the molec-ular systemic research ，genic inheritance breeding ，improving dosage formulation and enlarging control objects in Metarhizium spp．made a great progress ，but there is still a large gap compared to that of insecticidal microorganism such as Bt ．Therefore ，the screening of highly toxic strain of Metarhizium spp．should be explored ，and the influence of humidi-ty ，ultra－violet radiations ，soil microorganism ，and soil physical and chemical characteristics affecting Metarhizium spp．should be studied to enhance the controlling effects of Metarhizium spp．on target insect pests．
Key words ：Metarhizium spp．；classification ；separation ；identification ；biological characteristics ；application
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和各自所依据分种标准不一，因此也出现了对本属的鉴别性状和颜变化幅度等特征的描述不够明确具体的现象。迄今为止，Drive r等［2］的研究是最为详尽和完整的，基本解决了绿僵菌属中的分类难题。他们将绿僵菌划分为3个种：金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和白绿僵菌，其中黄绿绿僵菌下分5个变种，分别是黄绿绿僵菌新变种1、黄绿绿僵菌新变种2、黄绿绿僵菌新变种3、黄绿绿僵菌小孢变种、黄绿绿僵菌大孢变种；金龟子绿僵菌下分4个变种，分别是金龟子绿僵菌新变种1、金龟子绿僵菌新变种2、金龟子绿僵菌小孢变种、金龟子绿僵菌大孢变种。
2绿僵菌的分离与鉴定方法
2．1分离方法
常规方法多是从体表有明显真菌感染症状的僵虫上分离。1986年Zimmermann［3］将研究线虫在土壤中发生率的“大蜡螟诱饵法”（Galleria Bait Method）引入昆虫病原真菌生态学研究，检验昆虫病原真菌在土壤中的出现频率。此方法简便易行，可从土壤中诱集白僵菌、绿僵菌和拟青霉（Paecilomyces spp．）等病原真菌。黄运霞等［4］探索了从活虫体分离昆虫病原真菌的可能性，在广西全境采集活虫标本3764份，经检验有虫生真菌的334份，检出率为8．9％，其中检出率最高的是黄曲霉（Aspergillus flavus Link）为2．6％，绿僵菌的检出率为0．74％。有试验表明，将研究绿僵菌在土壤中动态的选择性培养基用于直接从土壤中分离绿僵菌效果更好，如Doberski［5］和Heck 等（参阅Lingg［6］）分别改进Veen等［7］设计的含（Cycloheximide）的选择性培养基，可快速分离土壤中的白僵菌、绿僵菌；Rath等［8］从塔斯马尼亚岛（Tasmania）的土壤中分离得到204株绿僵菌，他们测定了这些菌株对一种澳大利亚牧场金龟子（Adoryphorus couloni Burm）的致病力并得到高效生防菌株DATF－001。
由于寻僵虫的工作量大，易受季节限制，特别是从土栖昆虫中采集僵虫就更困难，因此采用土壤直接分离法和诱饵法来收集虫生真菌资源就显得尤为重要和迫切，应作为重点突破领域。
2．2鉴定方法
菌株的一般鉴定不困难，但是要鉴别分离的菌株是所引入的生防菌株就困难了，形态学的方法不适用。目前国外一般采用PCR法：利用PCR扩增病原菌核糖体ITS（Internal Transcribed Spacer），即转录间隔区，进行病原菌的鉴定、检测及病害诊断等［9～11］。此法快速、准确、简便，越来越受到病理学家的重视，这也为在分子水平上研究生物防治真菌提供了理论基础和操作向导。常用的分子标记有：限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、SCAR（Sequence Charac-terized Amplifiedregions）、微卫星序列（Simple Se-quence Repeat Polymorphisms，SSR）和扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等。分子标记技术可提供丰富的、高
分辨DNA指纹多态性数据，为生物种系统学和分类学的深入研究提供了前所未有的必要基础［12］。Riba G 等［13］使用限制性片段长度多态性（RFLP）和建立在PCR技术基础上的DNA随机扩增多态性（RAPD）方法研究昆虫病原真菌的分类鉴定、系统发育、种内分型和地理型分布，为研究其生态学和流行学提供了重要的检测手段。
上述鉴别方法都要经过分离这一繁琐的过程，随着现代生物学技术的进展，荧光抗体标记已用于土壤微生物的生态学研究［14］，用荧光显微镜能直接观察微生物在土壤中的分布情况，可省去分离这一步骤，是一种快速简便的研究手段。
3绿僵菌的生物学特性
3．1绿僵菌的生活力
环境条件对绿僵菌的生长影响较大，不同菌株要求的环境条件不同，通常在15～35℃条件下都能生长，其中以20～30℃为生长适温，最适生长和孢子形成的温度为25℃；在温度高于40℃和低于7～8℃时，分生孢子不萌发；菌丝在30℃条件下生长虽快，但不能很好地形成分生孢子。绿僵菌对湿度的要求更严格，生长发育要求空气相对湿度在93％以上，以98％～100％为最适。孢子的存活受物理和化学因素的影响，短时间紫外辐射就可使孢子活力迅速下降，在49℃时只能耐受10min［15］。温度与湿度对孢子存活的影响是相关的，在4℃时0RH和20℃时97％RH存活时间最长，可达两年［16］。 英联邦农业局国际生防所（IIBC）在探索利用昆虫病原真菌防治沙漠蝗虫时对黄绿绿僵菌进行了大量的研究。Stathers
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丁苗苗等：绿僵菌的研究现状及进展
等［17］和Mc Clatchie等［18］测定了M．flaveveride分生孢子在油剂中的存活力以及不同温度培养、储存对孢子活力的影响，结果表明，干的孢子粉在豆油中储存14周后（5℃和15℃）萌发率为92．1％；30℃培养的孢子对高温的抵抗力比在26℃培养的强。以往的研究只证明在4℃、空气相对湿度为0时孢子存活时间最长，但未给出此时的孢子含水量，所以这个含水量指标对绿僵菌杀虫剂的生产和储存具有指导意义。
3．2绿僵菌的毒力
菌株的毒力一般用活体生测法来确定。整个侵染过程一般可分为分生孢子的附着→出现分枝→萌发形成芽管→穿透表皮→大量聚合和入侵体内→绿僵菌分生孢子最终附着在节间膜上进入昆虫体内［19］。绿僵菌对昆虫的毒力，随菌株、环境条件和寄主昆虫而不同。林立辉等［20］用14株绿僵菌对同一蚊种或同一菌株绿僵菌对不同蚊种的毒力试验表明，其毒力差异很大，这与Daoust等［16］的
试验结果相似。探其原因，Daoust等认为这与孢子萌发率有关；但林立辉等用14株绿僵菌对致库蚊幼虫毒力试验结果表明，绿僵菌孢子萌发率与蚊幼虫死亡率并无明显关系。
正是由于菌株间存在着这种显著的毒力差异，因此，在绿僵菌防治害虫的实践过程中，人们在努力寻一种能够区别菌株毒力相关特性的检测手段。樊美珍等［21］分析了17株绿僵菌的酯酶同功酶谱，证明其酶谱与毒力有关。另外，有研究指出，培养基质与生长条件一样，同样能影响绿僵菌孢子的存活力和毒力。这种存活力和毒力主要依赖湿度和贮存条件，而培养基质则处于次要位置。
4绿僵菌的应用现状
绿僵菌的寄主范围比较广，能寄生直翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等8个目42个科200多种昆虫，还能寄生螨类及线虫等。和白僵菌一样，绿僵菌对人、畜和作物无毒害，是当前研究和应用最多的虫生真菌之一，利用绿僵菌对害虫进行微生物防治具有广阔的前景。据不完全统计，近年来世界各地用绿僵菌对近百种农作物、林木及卫生害虫进行室内防治效果评价，对150多种昆虫进行了小规模的田间防治试验，从防治规模看，已发展成为仅次于白僵菌的真菌杀虫剂［22］。在日本，安川荣曾试用金龟子绿僵菌防治金龟子获得初步成功，国外也曾有利用绿僵菌防治椰心叶甲的成功事例［23，24］。谢杏杨等［25］应用澳大利亚引进的美国品系绿僵菌，对家白蚁进行了成功的人工感染，在4~9d内能使供试白蚁全部死亡，而第3、4d感染的白蚁虫尸形成大量的该菌
孢子。童树森等［26］用含孢量2亿／mL的绿僵菌粉剂林间喷粉防治青杨天牛，连续2年防效70％以上。黄基荣等［27］在室内用绿僵菌液喷洒3种金龟子幼虫，黄闪丽金龟、棕鳃金龟和直蜉金龟子的感病率分别为90．2％、50．0％和83．3％。曾传芳等［28］利用从田间蔗根土天牛分离到的绿僵菌制成绿僵菌悬浮液浸蔗种1min，使蔗种带菌后下种，50d后调查幼虫的校正死亡率为85．8％；绿僵菌悬浮液喷到土中拌匀，然后将蔗茎和天牛置于其中，2d后天牛幼虫死亡率达100％；绿僵菌悬浮液浸种结果表明，菌液浓度越高杀虫效果越好，最高可达100％。于凤泉等［29］在水稻移栽后5～7d，田间用绿僵菌MaL03孢子悬浮液喷施1次，7～9d后采集田间稻水象甲成虫室内饲养1～10d有近50％染病死亡；首次处理后15d菌剂对稻水象甲成虫的防效为66．7％～88．3％，按卵密度计算菌剂的防效为59．0％～82．7％，按幼虫量计算的防效为68．4％～79．6％。程辉彩等［30］在试验小区内用绿僵菌油剂60mL／667m2设置罩笼药效试验，7～12d后发现大量蝗蝻死亡，施药后12d，小区虫口减退率为63．4％。
作为微生物杀虫剂的绿僵菌已经被许多国家登记注册，并投入生产和大规模的推广使用。澳大利亚蝗虫生物防治研究项目（CSIRO）研制出了杀蝗绿僵菌生物农药（Green Guard），并用于大面积草原蝗虫的防治，对蝗虫天敌等非目标生物安全；另外澳大利亚还登记了防治甘蔗金龟的绿僵菌产品（BioCane Granule）。目前4个绿僵菌产品（Biotrol FMA、Bio－Path TM、Bio－Blast和Back－off－1）已由美国EcoScience注册登记，分别用于防治蚊子、蜚蠊、白蚁、介壳虫和白粉虱。英国蝗虫
生物防治国际合作项目组（CABI Bioscience）研制的杀蝗绿僵菌生物农药（Green Muscle）已在非洲注册登记、投产，并大面积应用于沙漠蝗（Schistocer cagregaria）的防治，施药10~15d后防效达到90％以上，成为有效的蝗虫生防手段。巴西也注册登记了多个防治甘蔗沫蝉的绿僵菌产品（BioGreenTM、Biomax、Combio、Metobio、Metquin和Biocontro），此外，还登记有防治白粉虱
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的绿僵菌产品（Metarhizin）。德国登记了防治蛴螬的绿僵菌产品（Bio1020）。中国登记了防治蜚蠊的百澳克Bioc和防治蝗虫的蝗敌1号产品［31］。
当前国内外大面积推广、应用于农作物、森林、卫生等害虫防治的绿僵菌商品制剂主要是金龟子绿僵菌，对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、桃小食心虫（Carosin aniponensis）、玉米螟（Ostrinia lurnacalis）、甘蔗杆草螟（Diatraea saccharalis）、甘薯华叶甲（Colasposoma metallicum）、斜纹夜蛾（Prodenia litura）、刚竹毒蛾（Pantana phyllostachysae）、橄榄星室木虱（Pseudopha copteron anarium）、松褐天牛（Monochamus alternatus）、白杨透翅蛾（Paranthrene tabaniformi
s）、马尾松毛虫（Endrolimus punctatus）、德国小蠊（Blat-tella germanica）和黑翅土白蚁（Odontotermes for-mosanus）等害虫均有明显控制效果。国内重庆真菌农药研制工程中心获得的杀蝗绿僵菌孢子母粉和杀蝗生物制剂“蝗敌1号”已在我国北方部分蝗虫发生省区使用和推广［31］。在利用绿僵菌防治蔬菜害虫领域，国内外学者也作了相关研究，主要防治对象有蚜虫、白粉虱、蔬菜根蛆、蓟马和叶蝉类害虫、小菜蛾、菜粉蝶和棉铃虫等害虫。
在长期的剂型研究与害虫防治过程中，绿僵菌的剂型和应用技术也得到了长足发展。到目前为止，已研制出的剂型主要有：原粉剂、粉剂、可湿性粉剂、乳剂、油剂、微胶囊、混合剂及干菌丝等，与各剂型相配套的应用技术也随之得到发展。对于粉剂，常规的施药方法是喷洒孢子粉的水悬浮液防治地上害虫，或将孢子粉连同培养基一起撒在地面上然后翻入土中，防治农作物地下害虫。与粉剂相比，可湿性粉剂、乳剂和油剂更有利于孢子的分散与附着，尤其是油剂，其在低的相对湿度下更有利于孢子的萌发，同时在高温下也更能延长孢子的寿命，此外，油剂还有利于孢子对疏水基质的吸附，如昆虫体壁或植物表面［32］。Inyang等［33］研究了溶剂油对黄绿绿僵菌（M．anisopliae）分生孢子活性的影响，结果表明，菜子油、花生油或拉油是较好的溶剂油，制成的油剂（加有抗氧化剂）在17℃下贮藏127周后的孢子萌发率仍达到60％。
5展望
作为一种对有益生物无害，无二次中毒，不污染环境的可持续、低消耗，经济、社会与生态效益都
相当显著的生物制剂［34~36］，最近10多年，众学者对绿僵菌的研究在分子系统学研究、基因遗传育种、剂型的改进和扩大防治对象上更是逐级深入并取得较大的进展，但是与Bt等杀虫微生物的研究相比还有较大的差距。目前开发和即将开发应用的生防菌株多数源于从自然资源中直接筛选的菌株，因此外界环境对绿僵菌的防效影响很大：对于地上害虫的防治来说，影响最大的是湿度和紫外线，这主要依赖剂型的改进，添加能使孢子在低湿状态萌发的助剂和紫外保护剂［37］；对于地下害虫，土壤中的微生物和土壤的物理、化学性质影响孢子的存活和萌发。另外，高毒力菌株经过多代移植后会出现毒力衰减的现象已很普遍，而其原因至今还没有统一的认知；在选育优良菌株时所要用到的原生质体融合技术、遗传工程途径等在我国研究甚少；土壤抑菌作用对施用孢子活力的影响很大，这是在实施对地下害虫的生防中遇到的最重要的制约因子之一，这方面的研究我国也几乎是空白。因此，今后工作的重点就是立即着手这几个薄弱环节的研究。
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（责任编辑麻小燕）
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