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生物技术进展
２０１７年㊀第７卷㊀第１期㊀４３~５１
ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１
研究论文
Ａｒｔｉｃｌｅｓ
㊀收稿日期:２０１６￣０５￣３１ꎻ接受日期:２０１６￣０８￣０２
㊀基金项目：国家自然科学基金项目(３１３６０００２ꎻ３１４６０４５８)ꎻ云南高校科技创新团队支持计划[云教科(２０１４)２２号]ꎻ农业部公益性行业
专项(２０１３０３０１５)ꎻ云南省重点新产品计划(２０１４ＢＢ００５)资助ꎮ
㊀
作者简介：张小芳ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物细菌病害的研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:３８４９５２２４１＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ∗通信作者：姬广海ꎬ教授ꎬ主要从事植叶之枫
沙芦草物细菌病害研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:５５０３５６８１８＠ｑｑ.ｃｏｍ
张小芳１ꎬ㊀艾㊀瑛２ꎬ㊀魏兰芳３ꎬ㊀史恭林３ꎬ㊀王㊀星１ꎬ㊀李㊀凡１ꎬ㊀姬广海１∗
收容教养制度退出历史舞台１.云南农业大学ꎬ农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室ꎬ昆明６５０２０１ꎻ２.云南省玉溪市通海县植保植检站ꎬ云南玉溪６５２７００ꎻ３.云南农业大学ꎬ农科基础实验教学中心ꎬ昆明６５０２０１
摘㊀要：研究了４株生防菌对水稻白叶枯病的抑制作用和菌悬液浸种㊁浸芽㊁浇苗和包衣４种处理对水稻生长的促进作用ꎬ及对水稻体内过氧化物酶ＰＯＤ㊁多酚氧化酶ＰＰＯ㊁苯丙氨酸解氨酶ＰＡＬ３种保护酶的诱导表达作用ꎮ结果表明ꎬ４个菌株均对水稻幼苗有促生及诱导抗病性的作用ꎮ其中ꎬＷＹ２菌株诱导水稻抗病性和对水稻的促生性都要优于其他３株菌株ꎮ水稻幼苗接种生防细菌２４ｈ后再接种病原菌ꎬ生防细菌能促进植物体内保护酶ＰＡＬ㊁ＰＯＤ㊁ＰＰＯ活性的提高ꎬ进而诱导植物抗病性的提高ꎮ 关键词：生防细菌ꎻ促生性ꎻ诱导抗性ꎻ水稻细菌性条斑病ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１７.０１.０８
ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＰｒｏｍｏｔｉｎｇＡｂｉｌｉｔｙａｎｄＩｎｄｕｃｅｄＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌＢａｃｔｅｒｉａｉｎＲｉｃｅ
ＺＨＡＮＧＸｉａｏｆａｎｇ１ꎬＡＩＹｉｎｇ２ꎬＷＥＩＬａｎｆａｎｇ３ꎬＳＨＩＧｏｎｇｌｉｎ３ꎬＷＡＮＧＸｉｎｇ１ꎬＬＩＦａｎ１ꎬＪＩＧｕａｎｇｈａｉ１∗
１.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅＭａｎａｇｅｍｅｎｔꎬｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ
６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ
２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｕｎｎａｎＹｕｘｉ６５２７００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＴｅａｃｈｉｎｇＣｅｎｔｅｒꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｆｏｕｒｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｅｖａ
ｌｕａｔｅｄｆｏｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｉｎｒｉｃｅａｇａｉｎｓｔＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ.ｏｒｙｚｉｃｏｌａ
(Ｘｏｏｃ).Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｏｕｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｅｅｄｓｓｏａｋｉｎｇꎬｓｈｏｏｔｓｓｏａｋｉｎｇꎬｓｅｅｄｉｎｇｓｉｒｒｉｇａｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｄｐｅｌｌｅｔｉｎｇｗｉｔｈｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ.Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｓｕｃｈａｓｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄｐｈｅｎｙｌａｌｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｈａｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ.ＡｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＷＹ２ｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｓｔｒａｉｎｓ.ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｌａｎｔｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓａｓＰＡＬꎬＰＯＤａｎｄＰＰＯꎬａｎｄｉｎｄｕｃｅｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｈｅｎｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇＸｏｃｐａｔｈｏｇｅｎｓ２４ｈ
ｏｕｒｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａｉｎｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａꎻｐｒｏｍｏｔｉｏｎꎻｉｎｄｕｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎻｒｉｃｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒｅａｋ
鲸教学设计㊀㊀由各种病害造成的农作物损失严重ꎬ一般可达其总产量的３０％~４０％[１]ꎮ农业生产上ꎬ化学农药是防治植物病虫害的首选方式ꎬ但其长期的不合理使用造成了极大的负面影响ꎬ诸如化学农药的高毒高残留㊁病原菌与害虫产生抗药性㊁造成
水体土壤等污染ꎮ随着人们对食品安全的日益关注与可持续控制病虫害发展的需要ꎬ生物防治受到了国内外植物保护工作者的重视ꎮ植物病害的生物防治主要包括:①利用拮抗菌对病原菌的拮抗作用来防治病害ꎻ②诱发植物自身的抗病性ꎮ
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作为植物病害生物防治因子深入研究的细菌类很多ꎬ主要有：土壤杆菌属(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ.)㊁假单胞菌属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ.)㊁芽孢杆菌属(Ｂａ￣ｃｉｌｌｕｓｓｐｐ.)㊁欧文氏菌属(Ｅｒｗｉｎｉａｓｐｐ.)㊁短杆菌属(Ｃｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ.)㊁节杆菌属(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ.)和溶杆菌属(Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ.)等[２ꎬ３]ꎮ
目前ꎬ应用较多的生防细菌是芽孢杆菌ꎮ关于芽孢杆菌的生防促生机制ꎬ国内外学者进行了大量研究ꎬ普遍认为芽孢杆菌生防机制主要有营养和空间位点竞争㊁抗菌物质产生㊁溶菌作用和诱导植物抗病性等方面ꎮ林东等[４]发现枯草芽孢杆菌ＳＯ１１３对水稻白叶枯病菌具有强烈的抑菌作用ꎮ陈志谊等[５]报道ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ￣９１６菌株对水稻纹枯病的防效达５０％~８１％ꎬ且该菌株与井岗霉素按一定比例混合可提高后者防治水稻纹枯病的效果ꎮ胡剑等[６]从枯草芽孢杆菌０ＢＳ￣９８中分离纯化抗真菌蛋白ꎬ发现它对苹果轮纹病㊁芦笋枯萎病具有很强的抑制作用ꎮ顾真荣等[７]评估显示枯草芽孢杆菌Ｇ３对菜豆和茄子苗期病㊁菌核病以及番茄叶霉病具有很好的防效ꎮ
溶杆菌１９７８年由Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ和Ｃｏｏｋ命名[８]ꎮ溶杆菌属(Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ)细菌属于黄单胞菌科(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ)ꎬ该菌能够溶解一些病原细菌㊁真菌和线虫ꎬ产生抗生素㊁生物表面活性物质以及诱导寄主抗病性等ꎬ是一类具有极大生防潜力的生防菌ꎮＯᶄｓｕｌｌｉｖａｎ等[９]在１９８８年从溶杆菌属菌体细胞中分离得到的二盐基缩氨酸类抗生素ｌｙｓｏｂａｃｔｉｎ对革兰氏阳性细菌有较强的抑菌作用ꎮ１９９９年Ｍｄ等[１０]研究发现溶杆菌Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒｓｐ.ＳＢ￣Ｋ８８能够产生一种对甜菜瘁倒病有明显拮抗作用的抗生素ｘａｎｔｈｏｂａｃｃｉｎＡꎮ２００３年Ｌａｒｉｓｓａ等[１１]从溶杆菌Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒｓｐ.３.１Ｔ８上分离出一种对黄瓜瘁倒病有较好防治效果的抗生素ꎮ２００５年Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等[１２]研究产酶溶杆菌Ｃ３时发现一种新的具有热稳定性的抗生素物质(ＨＳＡＦ)ꎬ它通过调节神经酰胺酶的合成途径来改变菌丝的形态ꎬ从而达到控制病害的目的ꎮ
目前许多研究认为ꎬ诱导抗性有两种类型：一类是由病菌无毒菌株或无毒基因产物和一些化学因子诱导的系统性获得抗性(ＳＡＲ)ꎬ这类诱导抗性由诱导因子激发植物ＳＡＲ基因表达ꎬ产生一系列防卫反应如合成病程相关蛋白(ＰＲ)等ꎬ并由水杨酸介导[１３]ꎮ例如ꎬＯｎｇｅｎａ等[１４]系统研究了枯草芽孢杆菌对黄瓜(病)㊁烟草(霜霉病)㊁番茄(灰霉病)和大豆(灰霉病)的诱导抗病性信号传导途径和防卫反应基因表达差异ꎬ并首次证明枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素ｓｕｒｆａｃｔｉｎ和ｆｅｎｇｙｃｉｎ是诱导寄主植物产生防卫反应的激发子ꎬ它们与特定受体发生识别反应ꎬ从而激发植物依赖水杨酸(ＳＡ)途径的防卫反应ꎮ另一类是由根际促生细菌(ＰＧＰＲ)引起的诱导系统抗性(ＩＳＲ)ꎬ通常ＰＧＰＲ诱导的ＩＳＲ是由种子处理或土壤浇灌获得[１５]ꎮ
生防细菌因其具有防病效果好㊁对人畜安全和对环境无污染等优点而受到重视ꎮ实验室前期从云南省不同地区分离到了多株芽孢杆菌和溶杆菌ꎬ并在魔芋软腐病㊁烟草青枯病㊁水稻条斑病和水稻白叶枯病病原菌进行了室内抑菌试验初试ꎮ本文拟选用实验室分离保存的３株芽孢杆菌和１株溶杆菌对水稻的促生性及诱导抗性进行研究ꎬ为进一步研究和应用提供理论依据ꎮ
１㊀材料和方法
１.１㊀试验时间、地点
本研究田间试验于２０１４年５月在云南农业大学校内温室进行ꎬ室内试验在农业生物多样性国家工
程中心进行ꎮ
１.２㊀试验材料
供试生防菌株为解淀粉芽孢杆菌Ｃ３ꎻ甲基营养型芽孢杆菌Ｒ２￣２[１６]ꎻ解淀粉芽孢杆菌ＷＹ２ꎻ抗生素溶杆菌ＹＦＹ０２(申请专利ꎬ已受理)ꎻ水稻材料为感病品种ＩＲ２４ꎮ材料均由云南农业大学生物多样性国家工程中心细菌实验室提供ꎮ
１.３㊀生防细菌处理对水稻生长的促进作用１.３.１㊀菌液的制备及处理方法㊀所用菌株为Ｃ３㊁Ｒ２￣２㊁ＷＹ２㊁ＹＦＹ０２ꎮ将其生防菌液在营养肉汁琼脂ＮＡ培养基(葡萄糖１０ｇꎬ蛋白胨５ｇꎬ牛肉浸膏３ｇꎬ酵母浸膏１ｇꎬ琼脂粉１７ｇꎬ用去离子水混合配制１０００ｍＬ)上活化ꎬ２８ħ培养２ｄꎮ用移菌环挑取单菌落放于ＮＡ液体培养基中摇菌２４~３６ｈꎮ用分光光度计在６００ｎｍ下调ＯＤ值到０.５ꎮ将ＯＤ值为０.５的生防菌液按照１００倍㊁２００倍㊁５００倍的浓度梯度稀释ꎬ并分别用作浸种㊁浸芽㊁
４４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.
浇苗㊁包衣处理ꎮ浸种处理４８ｈꎬ每２４ｈ更换处理液一次ꎻ浸芽在种子出芽后用处理液浸泡４８ｈꎬ每２４ｈ更换一次处理液ꎻ浇苗在两叶期进行ꎻ包衣处理使用羧甲基纤维素ꎬ羧甲基纤维素与稀释菌
液按照１％的体积比混合在一起ꎬ羧甲基纤维素的浓度控制在０.２％ꎮ混合液置于装有种子的三角瓶中ꎬ在摇床中摇２~６ｈꎬ取出阴干ꎬ然后催芽播种ꎮ水稻材料采用感病品种ＩＲ２４ꎮ清水为对照ꎮ每个处理３次重复ꎬ每个重复３０粒种子ꎮ水稻播种３０ｄ后ꎬ到幼苗两叶期时调查促生效果ꎮ
１.３.２㊀测定指标与方法㊀苗高和根长：每个处理分别取水稻苗１０棵ꎬ测量各处理幼苗和根的长度ꎬ其中根以最长的一根为测量对象ꎬ以每一处理１０棵幼苗的平均值作为苗高(ｃｍ)和根长(ｃｍ)ꎮ根数：统计所有长度大于２ｃｍ的根的条数ꎬ最后同样取每一处理的所有参试幼苗的平均值ꎮ苗干重与根干重：将幼苗与根分开用吸水纸包好ꎬ自然风干后用０.００１ｇ天平称重ꎬ其重量除以幼苗数即为干重(ｍｇ)ꎮ
１.４㊀生防细菌处理水稻诱导抗性研究
经Ｃ３㊁Ｒ２￣２㊁ＷＹ２㊁１３￣６４株生防菌液处理后的种子播种长至抽穗期ꎮ将水稻细菌性条斑病菌在ＮＡ培养基上活化ꎬ２８ħ培养２ｄꎮ用移菌环挑取少量菌株放于ＮＡ液体培养基中摇菌２４~３６ｈꎮ加入适量无菌水制成菌悬液ꎬ用喷雾器均匀的喷洒在水稻叶片上ꎬ每个处理接种相同量的菌液ꎬ待２１ｄ后调查其诱导抗性效果ꎮ
１.５㊀生防细菌处理对水稻幼苗地上部３种酶活性的影响
水稻感病品种ＩＲ２４置２８ħ恒温培养箱光照培养ꎬ生长至三叶期时分别用Ｃ３㊁Ｒ２￣２㊁ＷＹ２㊁ＹＦＹ０２菌液处理ꎬ对照用清水ꎮ分别在处理的０㊁１２ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁９６ｈ时取叶片测定有关指标ꎮ１.５.１㊀过氧化物酶(ＰＯＤ)活性测定[１７]㊀标准曲线的制作：取２０ｍＬ具塞试管６支ꎬ编号ꎬ按下表配制四邻甲氧基苯酚标准系列溶液ꎬ混匀后以１号管调零ꎬ于４７０ｎｍ波长下测定吸光度ꎬ以标准液浓度为横坐标ꎬ吸光度为纵坐标绘制标准曲线ꎮＰＯＤ的提取及活性测定：取待测水稻叶片适量ꎬ剪碎混匀于研钵中ꎬ加少量石英砂㊁碳酸钙和适量蒸馏水ꎬ冰浴研磨成匀浆ꎬ蒸馏水定量至５０ｍＬꎬ摇匀后离心ꎬ上清液即为待测酶液ꎮＰＯＤ活性测定参照孙红炜等[１８]的方法ꎮ
ＰＯＤ活性测定[１９]：取２０ｍＬ具塞试管３支ꎬ２支测定(３个重复)ꎬ１支空白对照ꎮ各加入酶液１ｍＬꎬ０.１％愈创木酚１ｍＬꎬ蒸馏水６.９ｍＬꎬ摇匀ꎬ加入０.１８％双氧水１ｍＬ(对照用蒸馏水)ꎬ摇匀计时ꎬ２５ħ准确反应１０ｍｉｎꎬ加５％偏磷酸０.２ｍＬ终止反应ꎮ用标准曲线１号管调零ꎬ于分光光度计测定Ａ４７０的吸光值ꎮ
过氧化物酶活力＝(Ｘ－Ｙ)ˑＶｔ/ｗＦˑＶｓˑｔ
式中:Ｘ：测定管四邻甲氧基苯酚的含量(μｇ)ꎮＹ：对照四邻甲氧基苯酚的含量(μｇ)ꎮＶｔ：酶液总体积(ｍＬ)ꎮｗＦ：样品鲜重(ｇ)ꎮＶｓ：测定时取酶液的量(ｍＬ)ꎮｔ：酶作用时间(ｍｉｎ)ꎮ
１.５.２㊀多酚氧化酶(ＰＰＯ)活性测定㊀每个处理叶片准确称取０.１ｇꎬ剪碎ꎬ加２ｍＬ０.１ｍｏｌ/
Ｌ预冷的ＰＢＳ磷酸缓冲液和少量石英砂于冰浴下研磨成匀浆ꎬ４ħ下１２０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ将上清液移入另一容器中冰浴保存ꎮ反应系统中ꎬ以邻苯二酚为底物ꎬ反应成分包括０.０２ｍｏｌ/Ｌ邻苯二酚１.５ｍＬꎬｐＨ６.８的ＰＢＳ缓冲液１.５ｍＬ和１ｍＬ酶液ꎮ反应液先于３７ħ放置２ｍｉｎ后ꎬ测定ＯＤ３９８的光密度值ꎬ１０ｍｉｎ内每分钟记录一次光密度值ꎬ以不加酶液而加相同体积的缓冲液作为空白对照ꎮ以每分钟使ＯＤ３９８变化０.０１的酶量为一个酶活力单位ꎮ
酶活力＝әＯＤ３９８ˑＶ/０.０１ˑＶｔˑｗˑｔ
式中:０.０１：酶活单位ꎻＶ：提取酶液的总体积(ｍＬ)ꎻＶｔ：测定时酶液用量(ｍＬ)ꎻｗ：用于提酶的叶片重量(ｇ)ꎻｔ:әＯＤ３９８变化所用时间(ｍｉｎ)ꎮ
表１㊀标准曲线
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ.
试管号１２３４５６标准母液(ｍＬ)０１.２５２.５０５.００７.５０１０.００蒸馏水(ｍＬ)１０８.７５７.５０５.００２.５００标准系列含量(μｇ)０８.４１６.９３３.８５０.６６７.５５４
张小芳ꎬ等：生防细菌对水稻的促生性及诱导抗性研究. All Rights Reserved.
通风管路
１.５.３㊀苯丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)活性测定㊀称取适量的水稻幼苗组织ꎬ先加１.５ｍＬ预冷的提取液(即７ｍｍｏｌ/Ｌ巯基乙醇硼酸缓冲液)㊁过量的聚乙烯吡咯烷酮(但不能太多ꎬ否则不易研磨)㊁少量石英砂在冰浴下研磨成浆ꎬ再加３.５ｍＬ预冷的提取液使其终体积为５ｍＬꎮ于１２０００ｇ/ｍｉｎ４ħ离心１５ｍｉｎꎬ用吸管吸取上清液ꎬ上清液即粗酶液ꎮ
酶活的测定：反应液包括:０.０２ｍｏｌ/ＬＬ￣苯丙氨酸１ｍＬꎻ０.１ｍｏｌ/Ｌ硼酸缓冲液(ｐＨ８.８)２ｍＬꎻ
０.１ｍＬ粗酶液(对照以０.１ｍＬ巯基乙醇缓冲液代替酶液)ꎮ反应液用涡旋混合器混匀后立即在２９０ｎｍ处测起始ＯＤ值ꎬ并精确计时ꎬ每一样品重复两组ꎮ将测定后的各管于３０ħ水浴保温３０ｍｉｎꎬ再于２９０ｎｍ处测定各管的ＯＤ值ꎮ本实验以每３０ｍｉｎ在波长２９０ｎｍ处吸光率增加０.０１所需酶量为１个单位ꎮ
苯丙氨酸解氨酶活力＝３０ｍｉｎ内吸光度的差值ˑＶ/ａˑｗˑ０.０１
式中:ａ：测定时的酶液用量(ｍＬ)ꎻＶ：酶液总体积(ｍＬ)ꎻｗ：样品重量(ｇ)ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀生防细菌处理对水稻生长的促生作用
生防菌株的处理对水稻的生长均具有促进的作用ꎮ４株菌株ＹＦＹ０２㊁Ｃ３㊁Ｒ２￣２㊁ＷＹ２的促生作用见图１~４ꎮＹＦＹ０２的促生作用见图１ꎬ２００倍包
图１㊀生防细菌ＹＦＹ０２对水稻生长的促生作用
Ｆｉｇ.１㊀Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉｕｍＹＦＹ０２ｏｎｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈ.
６
４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
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图２㊀生防细菌Ｃ３对水稻生长的促生作用
Ｆｉｇ.２㊀Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉｕｍＣ３ｏｎｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈ.
衣为最优处理(Ｐ<０.０５)ꎬ它对水稻幼苗的促生效果最为明显ꎬ株高㊁根长㊁根数㊁苗干重和根干重等
５项指标均高于对照和其他处理ꎮＣ３㊁Ｒ２￣２㊁ＷＹ２菌株的处理中ꎬ５００倍包衣均为最优处理ꎬ株高等５项指标均高于对照和其他处理(图１~４)ꎮ以上说明的是相同菌株之间促生效果ꎮ不同菌株之间的促生效果见表２ꎬＹＦＹ０２菌株处理之后ꎬ有根长和苗干重两个指标均高于其他菌株处理ꎻＣ３则没有ꎻＲ２￣２菌株处理之后ꎬ有苗干重和根干重两个指标均高于其他菌株处理ꎻＷＹ２菌株处理之后ꎬ有株高㊁根数㊁苗干重３个指标均高于其他菌株处理ꎮ综合以上结果显示ꎬＷＹ２菌株包衣５００倍的稀释液处理水稻种子为最优处理ꎮ２.２㊀生防细菌诱导水稻抗病性分析
从图５可知ꎬ生防菌处理过的水稻苗再喷雾接种病原菌后ꎬ生防细菌对细菌性条斑病菌有明显的抑制作用ꎬ而只喷施细菌性条斑病菌菌液的水稻苗则发病比较严重ꎮＷＹ２菌株诱导水稻抗病性优于其他３个菌株ꎮ
２.３㊀生防细菌处理对水稻幼苗地上部３种酶活性的影响
２.３.１㊀接种生防菌后对植株ＰＯＤ的影响㊀由图６可以看出ꎬ接种４种生防菌后ꎬ水稻幼苗的ＰＯＤ活性明显增高ꎬ在接种后０㊁１２ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁９６ｈ的时间点上ꎬＰＯＤ值均以３６ｈ时的ＰＯＤ值最大ꎬ３６ｈ后ꎬＰＯＤ活性慢慢降低ꎮ４种生防菌诱
７４
张小芳ꎬ等：生防细菌对水稻的促生性及诱导抗性研究. All Rights Reserved.
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