作者：盛慧 彭军 李运 发布时间：2005-8-12 | ||||||||||||||||||||||||||||||
摘要：采用蛋白质沉淀和传统二氧化硫脱分析方法测定聚合素中单分子花素。葡萄和葡萄酒中两种聚合素：小分子素（SPP）与蛋白质不产生沉淀而大分子素(LPP)则产生。分析成熟期和采摘期赤霞珠、西拉葡萄浆果内的聚合物素成分，其果粒中含有的聚合素比相应的葡萄酒少。在葡萄酒中到的多数大分子聚合素是在葡萄酒酿造过程中产生的。通过对照，葡萄酒和其果粒中小分子素含量相比较是不稳定的、变化的，西拉中SPP降低，赤霞珠SPP增加，黑比诺SPP变化很小。蛋白质沉淀和二氧化硫漂白分析研究得出葡萄汁和葡萄酒中的单宁酸和聚合素有相同的结论。 关键词：聚合素 花青素 单宁酸 原花青素 成熟果实 蛋白质沉淀 Abstract：By combining protein precipitation and traditional bisulfite bleaching to determine monomeric anthocyanins from polymeric pigments. There are two classes of polymeric pigments in grapes and wines , small polymeric pigments (SPP) that do not precipitate with protein and large polymeric pigments (LPP) that do. during ripening and harvest, the polymeric pigment composition of Cabernet Sauvigon and Syrah berries are very little compared to the corresponding wines. the most of the LPP found in wines is formed during winemaking. By contrast, SPP in wines compared to fruit was variable, decreasing in Syrah, increasing in Cabernet Sauvignon, with little change in Pinot noir. Using protein precipitation and bisulfite bleaching analysis obtained the parallel determination of tannins and polymeric pigments in grapes and wines. Key words: Polymeric pigments, anthocyanin , tannin, procyanidin , fruit ripening, protein precipitation. 1．引言 葡萄籽和皮中的单宁酸是黄烷-3-醇聚合物，它包含儿茶酸、表棓儿茶酸、表儿茶酸、或多数连接在黄烷醇C4-C8键的表儿茶酸没食子酸。缩合单宁是来自于葡萄果粒的一种丰富的酚类物质，也是红葡萄酒中重要的收敛性成分。而花素葡糖苷（花青素）是来自于葡萄中的多酚物质经酰化成花素的糖苷。葡萄皮和籽中的单宁酸在葡萄酒酿造和熟化过程中与葡萄皮中的花青素形成聚合素。聚合素和单分子花青素区别在于不同PH值下的基本特性成分和对二氧化硫漂白的灵敏度，当PH值从1到5时，花青素水溶液在520nm处吸光率衰减迅速，而相同条件下聚合素的吸光率是稳定的；在520nm处亚硫酸盐溶液中聚合素显示吸光度时，红单分子花青素被亚硫酸盐离子漂白，这一特性是聚合素区别单分子花青素的简便方法。 通过对不同酒龄酒的分析，新酿制的葡萄酒含有明显的单分子花青素和少量的聚合素。十六年酒龄的葡萄酒中几乎所有的颜都来源于聚合素。同时也说明花青素和单宁酸直接反应形成聚合素的事实。 1995年普里斯（Price）等人阐述了使用反相高效液相谱法测定葡萄酒和葡萄汁中聚合素。 把萨莫斯（Somers）和埃文斯（Evans）的二氧化硫漂白法和反相高效液相谱法相互联系起来所得出的这种测定方法不受对位-香豆酰-葡萄糖苷花素的干扰。 在我们的分析中发现葡萄皮中蛋白质单宁酸沉淀再溶解后，在510nm处吸光值很小，这就表明收获期的葡萄果粒中聚合素含量低。红葡萄酒中的单宁酸和蛋白质产生沉淀再溶解后进行单宁酸分析，其溶液在510nm处有富足的吸光度，这表明在红葡萄酒的蛋白单宁酸沉淀中存在聚合素。红葡萄酒中被蛋白质沉淀转移的素少于聚合素的一半。因此，我们得出葡萄和葡萄酒中有两种类型的聚合素：小分子聚合素（SPP）与蛋白质不产生沉淀，大分子聚合素（LPP）则相反。社会调剂是什么意思 2．原料和方法： 2.1 牛血清蛋白（BSA） 、十二烷基硫酸钠（SDS）、三乙醇胺（TEA）、六水合三氯化铁、焦亚硫酸钾、 （+）-儿茶素（Sigma） 2.2 样品收集和果浆提取 所有浆果样品在2000-2001年葡萄季节中收集，生长八年的赤霞珠葡萄浆果，六年的黑比诺浆果，五年的西拉浆果。 前期收集样品的处理过程：三种不同的葡萄果粒，取20粒浆果为一个样品单位，进行称重、去皮分离。把浆果切成两瓣，将果皮、籽、中果皮分离，将20粒浆果样品的皮放进盛有20mL70%丙酮水溶液（v/v）的125mL锥形烧瓶中，锥形瓶口用橡胶盖密封，以100转/分轻摇萃取。 萃取液经过充分萃取后进行分液，在38℃条件下使用旋转蒸发仪将丙酮蒸发去除，残留物用去离子水定容到10mL，在-20℃下冷冻供分析使用。 2.3 聚合素分析： 采用Hagerman和 Butler（1997）的单宁酸分析方法，按比例减少测量葡萄酒或葡萄皮提取物，经过稀释和体积校准后测定吸光度。葡萄酒和葡萄皮提取物用含有5g/l酒石酸氢钾的12%乙醇（v/v）溶液稀释，用HCI调节其溶液PH值为3.3 。测量总吸光度、单宁酸沉淀和聚合物素都是在PH值为4.9 （用NaOH调节）的含有200mM乙酸和170mM NaCI的缓冲液中进行的。因单宁酸沉淀，缓冲液中加入BSA的最终浓度为1mg/mL。 分析葡萄酒或葡萄汁中的聚合素和单宁酸，每个样品需要两个1.5mL的离心管。第一个管中先加入1mL乙酸NaCI的缓冲液，然后加入500uL已稀释的葡萄皮提取物或葡萄酒并充分混合。取1ml混合液在520nm处测量吸光度（读为A）；继续加入0.36M焦亚硫酸钾80μL混合均匀，稳定10min 重新测定在520nm处的吸光度（读为B）。 在第二个1.5mL的离心管中加入含有BSA（1mg/mL）的1mL乙酸NaCI的缓冲液，然后加入500uL已稀释的葡萄皮提取物或葡萄酒。将混合均匀后的样品在室温条件下缓慢搅拌15min。稳定后，样品以27000r/min的转速离心，使蛋白质单宁酸沉淀形成颗粒状，取1mL上清液放入透明小玻璃管中,再加入0.36M焦亚硫酸钾80μL，摇匀稳定10min后，在520nm处测定吸光度（读为C）。吸光度取决于MP、SPP、LPP。LPP分别由（A-B）、C 和（B-C）给出。 2.4 聚合素和单宁酸分析 测量蛋白质单宁酸沉淀再溶解在510nm处吸光度，将第二管中取出的颗粒状蛋白质单宁酸用250uL乙酸/NaCI的缓冲液洗涤，转移剩余的单分子花素，样品以13500r/min湖北警官学院南院重新离心, 倒掉洗涤液，然后加入875μL含有5%SDS(w/v)和5%TEA(v/v)的缓冲液，待其蛋白质单宁沉淀后，溶解液放置于室温下10min ， 在510nm处测定吸光度。吸光度描绘出蛋白质沉淀物中聚合物素的数量，这和Harberton法测定单宁酸吸光度结果相同。 2.5 聚合素总量测定 取12个不同品牌的红葡萄酒，进行相关性比较研究。酒样分别使用Somers和Evans方法和蛋白质单宁酸沉淀法测定聚合物素。这12个葡萄酒包括九个赤霞株、两个梅鹿辄、一个黑比诺。 3. 结果与讨论 将所测定的12个不同品牌的红葡萄酒的蛋白质沉淀单宁酸吸光度分析结果和Somers和Evans方法测定聚合素得出的吸光度值进行比较，（图一为使用机辅翻译Somers和Evans方法所得到的结果）结果显示两种方法之间吸光度测定值没有相关性，因此与BSA产生沉淀的聚合素不是葡萄酒中所有的聚合素。用焦亚硫酸钾漂白单分子花素，在蛋白质沉淀上清液中有大量的剩余吸光度，这些便是没有和BSA产生沉淀的聚合素，由于带有三种以上儿茶酸或表儿茶酸的原花青素能够缔合和交联BSA蛋白，小分子聚合物素（SPP）不与蛋白质产生沉淀。由此可知，与BSA产生聚合物沉淀的为大分子聚合素（LPP）。 图一：通过蛋白质沉淀和二氧化硫漂白，测定出葡萄酒中一定数量的SPP和LPP。 图二：SPP+LPP总数与用Somers和Evans法测定的总聚合素结果相比较，得出好的相关性。 葡萄籽单宁酸溶液中加入单分子花素，与蛋白质作用生成沉淀，在520nm处测定重新溶解的蛋白质单宁酸沉淀的吸光度非常低，说明LPP的吸光度不单单归结于单分子花素对蛋白质沉淀的缔合作用。为更进一步的证实，我们在葡萄酒中加入不同数量的单宁酸得到大量的蛋白质单宁酸沉淀，然后定量分析葡萄酒中的单宁酸的数量和LPP的数量，将两者数值加和在一起。见表一，表明LPP吸光度测定结果改变非常小。 测定的葡萄酒中，LPP的吸光度和葡萄酒中的聚合素数量之间没有到相关性（图一），使用Somers和Evans法测定聚合素的结果和LPP+SPP的总和具有好的相关性。 在一些葡萄酒中，我们发现两种不同的聚合素其比率有相当大的变化（见表二）。测定成熟期和采摘期葡萄浆果中存在的素含量。在成熟期间，赤霞珠和西拉果皮中LPP和SPP的含量显示于图三。这些结果表明葡萄皮中含有的LPP数量较SPP非常少。图五中A、B表为在PH=4.9时，采摘期的西拉浆果中的LPP、SPP和单分子花素相互作用的度百分数，与其相应的连续两年的葡萄酒中度的比较。图四中显示的果粒中相互作用的单分子花素在总度中的百分含量低于葡萄酒的。这是因为在PH值等于4.9时520nm处分析单分子花素的吸光值很小。在图三和图四中的结果显示，多数LPP是在发酵过程中形成的。在西拉成品葡萄酒和浆果中的SPP度百分含量几乎相同（图三）。 采摘期赤霞珠和黑比诺果实中LPP、SPP和单分子素的百分含量与葡萄酒比较结果见图五。赤霞珠和黑比诺在葡萄酒中的LPP百分数含量高于采摘期果实。黑比诺在酿造过程中LPP和SPP有很小程度上增加。 形成红葡萄酒中稳定颜的聚合素，多数是由于聚合素和少量的单分子花素的存在。使用HPLC测定两年酒龄的红葡萄酒中的聚合素数量占酒中度的50％，四年酒龄为75％，10年酒龄为95％ 。 在蛋白质沉淀定量分析单宁酸中，510nm处红葡萄酒的蛋白质单宁酸沉淀有相当大的吸光率。当醋酸盐缓冲液的PH=4.9时，BSA的等电点（Pi） 是4.9 ，该条件下单宁酸的蛋白质沉淀量最大，此时单分子花素吸光率最小。 测定收获期赤霞珠的汁和西拉果皮发现，LPP含量少于SPP。收获期果皮中LPP和SPP的百分含量和酒中测定结果比较，得出酒中聚合素LPP含量高于葡萄果实，LPP优先于SPP提取似乎不太可能，我们认为LPP量比SPP多是在酒的酿造过程中形成（见表 1.马球比赛）从许多地区的。（取不同的葡萄收获期的同一品种的140个葡萄酒样品测定，得出比率值的范围为0.14-2.2 。 澳洲葡萄品系中没有素成分沉淀和二氧化硫的漂白（SPP），这些酒是低分子量，对二氧化硫的漂白作用有抵抗力。我们认为SPP成分内包含儿茶酸-锦葵素-3-葡萄糖苷加合物，和其他素一样，乙醛使花素和黄烷-3-醇类聚合形成素的二聚物、三聚物,包含花青素的LPP成分直接和葡萄皮和籽中聚合黄烷3-醇类反应，或通过乙醛共聚增加聚合素与BSA的沉淀量。 LPP和SPP之间的特性对于生产精制红葡萄酒使用蛋白有实际意义，我们期望精制葡萄酒酒中含有高的LPP/SPP比来释放更多的聚合素。
参考文献： 1．《葡萄酒酿造学原理及应用》〔美〕Roger B. Boulton Vernon L. Singleton Linda F.Bisson Ralph E. Kunkee 著 赵光鳌等译中国轻工业出版社 2．《葡萄酒分析化学》秦含章 编著 中国轻工业出版社 3．《葡萄酒科学与工艺》〔法〕E.卑诺 著 朱宝镛 赵光鳌 张继民 刘吉良 译 中国轻工业出版社 4．Separation of Anthocyanin Pigments in Wine by Low Pressure Column Chromatography By Tony V. Johnston and Justin R. Morris. JFoodSci 61(1):109-11 1996 5．Color and Color Stability of Red Wine from Noble (Vitis rotundifolia Michx.) and Cabernet Sauvignon (Vitis vinifera L.)at Various pH ARstHortSoc By Charles A. Sims and J.R. Morris . 105:90-96 1984 Charles A. Sims and J.R. Morris , Research Assistant and Professor Department of Food Science, University of Arkansas Fayetteville, AR 72701. 6．Anthocyanins and their Chemistry in Wine . By Andrew Parley in partial fulfulment of the requirements for M. Appl. Sci. 7．Hagerman, A.E.; Butler, L.G. Protein precipitation method for the quantitative determination of tannins. Journal of Agriculture and Food Chemistry 1978, 26, 9．Condensed tannins of rapeseed :New finding and challenges By Marian Naczk , Ryszard Amarowicz , Fereidoon Shahidi | ||||||||||||||||||||||||||||||
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