第３４卷第１期２０２１年３月 仲恺农业工程学院学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖ
ｏｌ．３４，Ｎｏ．１Ｍａｒｃｈ，２０２１ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－５６６３．２０２１．０１．００２
收稿日期：２０１９－１０－０５
基金项目：广东省重点领域研发计划（２０１８Ｂ０２０２０５００３）、广东省大学生创新创业训练计划（Ｓ２０１９１１３４７０３９）资助项目．作者简介：舒永馨（１９９６－），女，贵州铜仁人，在读硕士研究生． 通信作者：Ｅ ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｚｈａｎｇｙｏｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
舒永馨１，２，罗 梅１，２，陈欣瑜１，２，向梅梅１，董 亚２，董章勇１
，２
（１．仲恺农业工程学院植物健康创新研究院，广东广州５１０２２５；２．仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东广州５１０２２５）
摘要：通过组织分离方法对广东省化州市橘红种植园内所采的化橘红（ＥｘｏｃａｒｐｉｕｍｃｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓ）果、枝、叶组织内的内生真菌多样性进行研究，并采用形态与分子生物学相结合的方法鉴定菌株．结果显示，从化橘红果、枝、叶６００个组织块中，共分离得到４０４株内生真菌．依据形态鉴定及ＩＴＳ序列分子鉴定，初步鉴定３７９株内生真菌，并将其分为１６个分类单元，经鉴定归于镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、菌属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、二孢菌属（Ｌａｓｉｏｄｉｐ ｌｏｄｉａ）、间座壳属（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ）、光黑壳属（Ｐｒｅｕｓｓｉａ）、稻黑孢菌属（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）、拟盘多毛孢属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）、弯孢属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）、隔孢伏革属（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）、叶点霉属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ）、枝孢属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、球腔菌属（Ｍｙｃｏ ｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、假尾孢属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、附球菌属（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ）、拟层孔菌（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）和毛霉属（Ｍｕｃｏｒ），其中菌属与间座壳属是化橘红的优势菌株，其相对频率分别为４４ ６％和３４ ２％，远远高于其他类．内生真菌在枝组织中的分离率为９１％．研究结果表明化橘红内生真菌分布具有一定的组织特异性，为进一步从化橘红内生真菌中筛选活性中药成分提供了新思路．关键词：化橘红；内生真菌；多样性 中图分类号：Ｓ４３２ １ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７４－５６６３（２０２１）０１－０００８－０４
ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｘｏｃａｒｐｉｕｍｃｉｔｒｉ
ＧｒａｎｄｉｓｉｎＧｕａｎｇｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ
ＳＨＵＹｏｎｇｘｉｎ１，２，ＬＵＯＭｅｉ１，２，ＣＨＥＮＸｉｎｙｕ１，２，ＸＩＡＮＧＭｅｉｍｅｉ１，ＤＯＮＧＹａ２，ＤＯＮＧＺｈａｎｇｙｏｎｇ
１，２
（１．ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＨｅａｌｔｈ，ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｆｒｕｉｔ，ｓｈｏｏｔａｎｄｌｅａｆｔｉｓｓｕｅｓｏｆＥｘｏｃａｒｐｉｕｍｃｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｍｅｄｉｕｍｔｉｓｓｕｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎｔｈｅｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆＥｘｏｃａｒｐｉｕｍＣｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓｉｎＨｕａｚｈｏｕＣｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｃｏｍｂｉｎｅｄｍｅｔｈｏｄｓｔｏｉ ｄｅｎｔｉｆｙｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ４０４ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ６００ｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｓｏｆｏｒ ａｎｇｅｆｒｕｉｔ，ｂｒａｎｃｈｅｓａｎｄｌｅａｖｅｓ．ＢａｓｅｄｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，３７９ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｎｉｔｉａｌｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ１７ｃａｔｅｇｏｒｙ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ ｆｉｅｄａｓＦｕｓａｒｉｕｍ，Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ，Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ，Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ，Ｐｒｅｕｓｓｉａ，Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ，Ｃｕｒｖｕ ｌａｒｉａ，Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ，Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ，Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ，Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ，Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ，Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ，Ｆｏｍｉｔｏｐ ｓｉｓ，Ｍｕｃｏｒ，ｉｎｗｈｉｃｈＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｎｄＤｉａｐｏｒｔｈｅａｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＥｘｏｃａｒｐｉｕｍＣｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓ，ｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓｏｆ４４ ６％ａｎｄ３４ ２％，ｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｒ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｘｏｃａｒｐｉｕｍｃｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
植物体内普遍存在众多内生真菌，因其寄生在没有表现症状的健康植物组织内部，因此植物内生真菌的存在和作用长期以来未被发现．直到２０世纪３０年代，由于牲畜食用了带有内生真菌的牧草，发生了大面积牧畜中毒事件给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生真菌有了初步认识［１］．化橘红（ＥｘｏｃａｒｐｉｕｍｃｉｔｒｉＧｒａｎｄｉｓ）亦称为化州柚，是广东省化州市的特产，有“南方人参”之称．其具有散寒利气、化痰止咳、健胃消滞的功效［２］．产品畅销国内外市场，供不应求，经济效益相当可观［３］．目前对于化橘红的研究主要集中在品种分类、有效化学成分的提取、化学成分检测与品质鉴别、药理及临床研究、分子水平的遗传多样性研究、组织培养以及化橘红的栽培与管理以及病虫害管理等方面［２－５］．关于化橘红的内生真菌的研究还未见报道．本文对化橘红的内生真菌进行分离鉴定，对其多样性进行分析，为进一步挖掘药用植物的内生真菌资源，以
及药用植物内生菌资源的开发与利用奠定基础．
１ 材料与方法
１ １ 供试植株
化州橘红健康植株于２０１９年５月自广东省化州市化州橘红种植园区进行单次多点采样．样品采集后，立即放入密封袋，保湿存放，带回实验室放置于４℃冰箱，３ｄ内完成内生真菌分离．
宇扬集团
分离培养基参照张云霞等［６］及方中达［７］的方法，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）、植物组织煎汁（Ｐ＋Ｊ）、ＬＣＡ培养基、麦芽糖酵母粉培养基（Ｍ＋Ｊ）和马丁氏培养基（ＭＤ）等５种培养基．其中植物组织煎汁采用化橘红组织样品进行．鉴定培养基为在ＰＤＡ培养基．
１ ３ 内生真菌的分离
参照常规的组织分离法［７］，并稍作修改：先将采回的健康化橘红的枝条、果实和叶片用自来水冲洗干净后再用无菌水冲洗，放在超净工作台的滤纸上晾干水分后将叶剪成约３ｃｍ×３ｃｍ的小片、枝条剪成３ｃｍ长的小段，果实切成３ｃｍ３的小块．将叶、枝条和果实分别用体积分数７５％的酒
精漂洗４０、９０和５０ｓ，再分别用体积分数２ ５％的次氯酸钠漂洗６、８和８ｍｉｎ，再用无菌水清洗３次，随后置于无菌滤纸上．待其水分吹干后将上述处理材料边缘的０ ５ｃｍ剪掉后，剩余部分剪切成０ ３ｃｍ×０ ３ｃｍ的小片（或０ ３～０ ５ｃｍ长的小段），分别将组织移置于５种分离培养基上于２５℃培养箱培养，每皿６～９块组织．第二天开始每日观察，将组织块边缘长出的新鲜菌丝转入到ＰＤＡ平板上进行常规培养．
１ ４ 表面灭菌效果的检测
参照Ｓｃｈｕｌｚ等［８］方法，并稍做修改．设两种植物材料表面灭菌效果检验方法．漂洗液检验法：把最后一次漂洗材料的无菌水均匀涂布于ＰＤＡ培养基平板上，２８℃培养７ｄ．组织印迹法：将经上述表面灭菌处理的完整枝段、叶片和果肉压入马铃薯葡萄糖培养基平板内，使表面灭菌材料与ＰＤＡ培养基接触３０ｍｉｎ，移去灭菌植物材料，２８℃培养７ｄ．１ ５ 内生真菌的鉴定
观察菌落形状、颜、大小、生长速率、分泌物和质地等特征［９－１２］．通过形态鉴定无法区分的真菌结合其ＩＴＳ序列进行分析．使用ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ，ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列扩增引物为ＩＴＳ１／ＩＴＳ４［１３］，扩增产物送天一辉远生物技术有限公司测序，测序结果在ＮＣＢＩ上利用ＢＬＡＳＴ进行比对分析．１ ６ 内生真菌的多样性分析
以分离率（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ＩＲ）、相对频率（Ｒｅｌ ａｔｉｖｅｆｒｅｑｕｅｎ
ｃｙ，ＲＦ）和定殖率（Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅ，ＣＲ）为指标进行多样性分析［１４－１６］．
２ 结果与分析
２ １ 化橘红内生真菌种类及分布
对采集的化橘红植株的内生真菌进行了分离培养，从其果、枝和叶共６００个组织块中共分离得到４０４株内生真菌．依据形态鉴定及ＩＴＳ序列分子鉴定，初步鉴定了３７９株内生真菌，并将其分为１６个分类单元，经鉴定归于镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、菌属（Ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、二孢菌属（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏ ｄｉａ）、间座壳属（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ）、光黑壳属（Ｐｒｅｕｓｓｉａ）、稻黑孢菌属（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）、拟盘多毛孢属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉ ｏｐｓｉｓ）、弯孢属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）、隔孢伏革属（Ｐｅｎｉｏ ｐｈｏｒａ）、叶点霉属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ）、枝孢属（Ｃｌａｄｏｓｐｏ ｒｉｕｍ）、拟层孔菌（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）、球腔菌属（Ｍｙｃｏ ｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、假尾孢属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、毛霉属（Ｍｕｃｏｒ）和附球菌属（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ）（表１）．
化橘红内生真菌种类较为丰富，但各类的数量有一定的差异．其中菌属和间座壳属是化橘红的优势种．菌属共分离到１８０株，相对频率为４４ ５％；其次是间座壳属，共分离获得１３８
株，相对频率为３４ ２％．除了叶点霉属在叶片和枝条上分别分离了２３和１０株，相对较多；其他内生真菌的相对频率均较小（表１）．
２ ２ 化橘红不同组织内生真菌的种类组成
化橘红不同组织中内生真菌的数量和种类存在
９
北京市民卡 第１期 舒永馨，等：广东化橘红内生真菌多样性分析
明显差异．枝条中的内生真菌最为丰富，分离率最高，为０ ９１；其次是叶和果，分别为０ ６６和０ ４５．内生真菌种类也与分离率呈相似趋势，枝条分离出１２个属的内生真菌，叶和果实分别分离出７和６个属的内生真菌．
化橘红内生真菌的分布具有明显的组织特异性．其中叶以菌属和叶点霉属为优势种，相对分离频率分别为６８ ４２％和１７ ２９％；在枝组织，间座壳属和菌属为优势种，相对分离频率分别为４４％和３０％；而化橘红果组织的优势种为菌属和间座壳属，相对分离频率分别为３７ ７８％和５６ ６７％．拟盘多毛孢菌属和假尾孢菌属是叶组织的特有种，仅在叶片内分离，在根和果中未出现；二孢菌属、隔孢伏革属、枝孢属、毛霉属、附球菌属和弯孢属是枝组织的特有种
；拟层孔菌属是果中的特有种（表１）．
表１ 化橘红不同组织内生真菌的种类１）
叶枝果
菌株数相对频率／％菌株数相对频率／％菌株数相对频率／％镰刀菌属－－２１．１１２２．２２菌属９１６８．４２５６３０．９０ ３４３７．７８二孢菌属－－５２．７６－－间座壳属８６．０２７４４０．８８ ５１５６．６７光黑壳属１０．７５１０．５５－－稻黑孢菌属－－１０．５５１－拟盘多毛孢属４３．０１－－－－弯孢属－－１０．５５－－隔孢伏革属－－１０．５５－－叶点霉属２３１７．２９１０５．５２－－拟层孔菌－－－－１１．１１枝孢属－－６３．３１－－球腔菌属１０．７５－－１１．１１假尾孢属１０．７５－－－－毛霉属－１０．５５－－附球菌属－－１０．５５－－未鉴定４３．０１２２１２．１５ ００．００合计１３３１８１９０
１）－表示未分类到该类．
２ ３ 化橘红内生真菌在不同培养基上的定殖率化橘红不同组织块在不同培养基上的定殖率存在着一定的差异，叶片在Ｐ＋Ｊ培养基上的定殖率较低，为５％；果在ＭＤ培养基上定殖率也相对较低，为２ ５％；枝条的定殖率相对于叶片和果实的定殖率均相对较高，且在ＭＤ培养基上的定殖率达到了最高，为１８ ５％（表２）．
表２ 化橘红内生真菌在不同培养基上的定殖率
培养基
选煤论坛
汗译英叶枝果
定殖组织数定殖率／％定殖组织数定殖率／％定殖组织数定殖率／％
ＰＤＡ２５１２．５３２１６．０１４７．０Ｐ＋Ｊ１０５．０２３１１．５１２６．０Ｍ＋Ｊ２６１３．０２９１４．５２０１０．０ＭＤ３０１５．０３７１８．５５２．５ＬＣＡ２１１０．５３０１５．０１９９．５合计２００２００２００
３ 结论与讨论
本研究首次采用组织分离法对化州橘红植株内生真菌进行分离，分离得到内生真菌４０４株．利用形态学与ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列分析相结合的方法将３９７株内生真菌鉴定为１６个分类单元，菌属和间座壳属为化橘红的优势菌株，二孢菌属、隔孢伏革属、枝孢属、毛霉属、附球菌属和弯孢属是枝组织的特有种，拟层孔菌属是根组织的特有种，拟盘多毛孢菌属和假尾孢菌属是叶组织的特有种．
０
１ 仲恺农业工程学院学报第３４卷
Ｃａｒｒｏｌｌ等［１７］通过研究了７种针叶树的内生真菌，发现不同的部位内生真菌的种有显著差异，提出了内生真菌种有一定的组织专一性的假说．张云霞等［６］从阳春砂分离的内生菌在不同组织部位存在着差异性，其中菌是其优势菌；段荣婷等［１８］分离的滇重楼在云南弥勒和临沧两地的内生真菌菌也存在着差异性，但是链格孢属（Ａｌ ｔｅｒｎａｒｉａ）和曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）为分离到的所有内生真菌中的优势菌种．本试验的结果显示化橘红内生真菌也存在组织差异性与特异性．从研究来看，优势种在植物的不同部位及相同植物在不同的地区均有可能不一样．
本研究采用了５种分离培养基，化州橘红叶片与枝条在ＭＤ培养基上的定殖率较高，其果实在Ｍ＋Ｊ培养基上的定殖率较高．徐全智等［１９］在分离内生真菌时使用ＰＤＡ、燕麦琼脂培养基（ＯＡ）及植物煎汁等３种培养基，侯晓强等［２０］仅使用了ＰＤＡ进行分离培养．从试验结果来看，利用不同的培养基能一定程度上丰富分离获得的新菌株，在分离内生菌的时候有必要利用多种培养基进行分离．但具体每一种植物更适用哪一种培养基来进行分离可能存在一定的差异性．
虽然内生真菌在２０世纪３０年代，已经被初步认识与探究，但对于植物组织内生真菌的研究方法还未得到规范统一，植物内生真菌研究方法还需要进一步探究．而本研究虽然分离鉴定了化橘红的内生真菌，而此鉴定尚在初步阶段，其鉴定及菌的利用价值还需要进一步进行研究．
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