质粒DNA的提取——碱变性提取法

一、实验目的

1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。

2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理

碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的

质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

三、实验仪器和材料试剂

仪器：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管，三角瓶等

菌体：含质粒puc19菌株 E.coli DH5α受体菌

试剂：LB培养基，氨苄青霉素AP，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液1X，上样缓冲液。

四、实验步骤

1. 含质粒puc19菌株的培养及收获

E.coli DHSα（puc19）→LB培养基+AP→37宽带直流放大器°c 12~16h→LB培养基+AP→37°c 4~6h→500μl管称重 (14.239g) →取菌液300μl→配平离心6000转 5min→弃清→加5ml Sol I混匀→6000转停电宝 5min→弃清→称重(菌体与离心管总重量为14.425g)→菌体称重（0.187g）

2. 细胞裂解提取质粒DNA

加 Sol I 2ml 菌体漩涡混匀，冰浴5min

加Sol II 2ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min

加Sol III 1.5ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min

平衡，12000转 15min→转上清至新50ml管（V1=8.8ml）

加（2V1=17.6ml）冰乙醇，颠倒混匀→-20°c 30min

12000转 15min→弃上清→5ml 70%乙醇洗涤

12000转 2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min

1mlTE溶解→粗提物物探软件

3. 质粒DNA的纯化

1.0ml粗提物+100μg RNaseA→37°c 1~2h→等分500μl x2份→加等体积分液，混匀→12000转 5min→转上清至新管→加等体积酚，氯仿异戊醇→12000转 5min→转上清至新管→加等体积氯仿异戊醇混匀→12000转 5min→转上清于新管→加1/10体积=22.0μl 3M NaAc，混匀，此时两管中液体体积均为242μl→加2倍体=484μl的积冰乙醇混匀→-20°c 30min→12000转 15min→弃上清→70%乙醇 500μl洗涤→12000转 2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min→25μl TE管溶解→共50μl质粒DNA/组

4. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA

五、实验结果

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

DL 2000

湖南确诊h5n6

JS-6(-)

JS-4(-)

λDNA

JS-9

JS-8

JS-7

JS-6

JS-5

JS-4

JS-3

JS-2

JS-1

pUC19

pUC19/HindII

λDNA hindII

1.本次试验电泳条带还算清晰，点样处有亮带，说明有杂蛋白

肉足虫

2.染体DNA条带比较暗，说明含量很低，提取样品纯度还算理想

3.与marker比较我们提出的质粒分子量在范围之内

4.与未添加RNase相比较，我们未出现模糊条带，证明RNase效果明显且操作方法正确

5.出现RNA条带可能的原因是RNase反应时间不够或者反应混合不充分造成埃及

六、注意事项

1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

2.注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。

3.溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。