原因分析：
1、PCR引物的设计
表1 含酶切位点引物序列
基因 | 引物序列 | 酶切位点 | 长度(bp) |
Cas9 | F:5’GCGGATCCATGGCCCCAAAGAAGAAGCG 3’ R:5’CGGAATTCGTCGCCTCCCAGCTGAG3’ | BamHⅠ EcoRⅠ | 4200 |
eGFP | F:5‘CGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAG3’ R:5’CCGCTCGAGCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTCTTGTACAGCTCGTCCATGC3’ | EcoRⅠ XhoⅠ | 723 |
| | | |
选用酶切位点：BamH 1 EcoR 1 Xho 1
保护碱基： GCGGATCCGC CGGAATTCCG CCGCTCGAGCGG
保护碱基添加无错误，猜测酶切位点处是否有甲基化现象，导致PCR出的片段缺少碱基，致 2、PCR产物酶切不完全导致连接不成功
Cas9基因两头的把手太短，虽然有保护碱基，但也可能酶切少一两个碱基或者多出来一两个碱基，电泳后，无法从电泳图上看出是否酶切完全，电泳条带基本无变化，导致连接不成功。
3、酶切时酶失活导致连接不成功
选用EcoR1限制性内切酶对pGEX-6p-2质粒进行单酶切，转化后由实验菌落数可知，自连组菌落数稀少，连接组菌落数茂密，可推出结论： EcoR1限制性内切酶正常工作，T4 DNA连接酶正常工作；
选用BamH1限制性内切酶进行实验，实验结果同上，可得出BamH1限制性内切酶正常工作，即，内切酶与连接酶均正常。
4、提取的质粒不够纯导致连接不成功
选用新买的质粒小提试剂盒，提质粒步骤应该无错误，怀疑加漂洗液时乙醇未能完全挥发，
导致质粒不纯。
5、Cas9基因片段不纯造成连接不成功
对PCR后的Cas9基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收时加入漂洗液PW后乙醇未能完全挥发，残留于回收后的Cas9基因中，怀疑其在连接体系中发挥作用，导致连接不成功。 解决方案：重新对Cas9进行PCR，在切胶回收步骤中，依次加入600µlPW后，空离心2min后，并将吸附有Cas9的柱子置于一空离心管中，放置于超净工作台，通风10min，使乙醇充分挥发，已成功制备。
6、感受态细胞转化率太低导致转化不成功
转化率：每ug质粒转化出来的单菌落个数，一般5×106～2×10７转化子/ug为适。
转化率 = 菌落数 / DNA质量 =（菌落数×稀释倍数）/（浓度×体积）
采用标准质粒pUC19进行转化，测得转化率如下：
即感受态细胞转化率足够，推出是连接体系太大无法转化或者是连接体系没有连上导致实验失败。细胞凋亡
7、连接体系比例不对导致连接不成功
载体和插入片段的摩尔比应该在1：2-10之间（1：5-8最适）
公式：p狂想曲数码mol数×kb数（双链）×0.65=微克数
pGEX-6p-2和Cas9的浓度均为10ng/ul（琼脂糖凝胶电泳估测）
按照1：5的摩尔比计算，体积比为1:7
400公里动车组下线表2 连接切体系（10µl体系）
反应物 | 加样顺序 | 体积1/µL | 体积2/µL | 体积3/µL |
钢骨混凝土10 x Buffer | 1 | 1 | 1 | 1 |
质粒 | 2 | 1 | 0.5 | 2 |
酶切后PCR片段 | 3 | 7 | 3pi调节器.5 | 6.5 |
T4 DNA 连接酶 | 4 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
DdH2O | 5 | 0．5 | 4.5 | 0 |
| | | | option60 |
连做三组实验，转化后均无菌落生长。怀疑是体系中其他成分，或质粒载体或基因片段存在问题，导致连接不成功，连接体系比例本身应无问题。
8、连接温度和连接时间的影响
连接温度和时间之前一直采用22℃连接过夜，但由于之前天气影响，时常为24℃连接过夜，可能温度对其产生一定影响，导致连接不成功。查看其T4 DNA连接酶的说明书，知其22℃连接3小时即可成功连接，在检测BamHI和EcoRI限制性内切酶以及T4 DNA连接酶是否有效时，采用22℃连接3小时进行连接，结果菌落生长状态良好，即22℃连接3小时足够连接成功。
9、质粒跟片段太长导致连接不成功
质粒长度为4980bp；Cas9基因长度为4200bp,怀疑两种片段太大，导致连接不成功。
解决方案：重做两组连接体系，一号管：质粒与片段摩尔数比为1:7；二号管：质粒与片段摩尔数比为2:6.5（防止质粒浓度太低造成影响），两组实验互相对照，22℃连接3小时。对其琼脂糖凝胶电泳1小时20分钟，测其在9000bp左右是否有亮带，若有，则证明连接成
功，转化不成功导致实验失败；若没有，则证明连接不成功，导致实验失败。（正在进行连接验证）
10、连接后的质粒太大导致转化效率低
质粒长度为4980bp；Cas9基因长度为4200bp,连接成功后的质粒片段长度为9000bp左右，质粒太大不好转化，导致实验失败。
11、切胶回收试剂盒对末端有损伤
尽量选用进口胶回收试剂盒
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