质粒线性化及纯化的标准操作规程

五年计划

质粒线性化及纯化的标准操作规程（编号：006）

1、目的及适用范围

将重组质粒线性化以用于毕赤酵母电转化，实现重组质粒在毕赤酵母基因组的整合。

2、主要试剂及仪器

37℃水浴锅、无菌水、10xL Buffer、重组质粒、SacI、苯酚、氯仿、3M pH5.2的NaAC

3、操作步骤

大量提取重组质粒，并用SacI单酶切将其线形化。

线形化反应200μL体系为：

联想i750ddH2O 145μL

8510w

10xL Buffer 20μL

重组质粒30μL(约15μg)

SacI 5μL

充分混匀后，37℃消化约5h，然后取2μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否完全线性化。将线形化质粒进行抽提，使其达到电转化所需要的纯度，具体步骤如下：

3.1 在进行线形化反应的EP管中补加无菌去离子水至总体积500μL。

3.2加入等体积的酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，每次充分混匀后12000rpm离心5min。商业银行流动性风险管理指引

3.3 将上清移至新的离心管中，加入1/10体积的3M pH5.2的NaAC和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，充分混匀后放置1h，12000rpm离心5min，预冷的70%乙醇洗涤2次，干燥后用10μL灭菌双蒸水溶解-20℃保存备用。

4、注意事项

选择的线性化酶在目的基因里不能有酶切位点，酶切时间一定要充分，将大部分的质粒都能线性化。

5、问题向导

你的知识需要管理酶切时间问题

电耗

本文发布于:2024-09-23 04:34:27，感谢您对本站的认可！

标签：质粒线性化重组进行

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