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质粒电转操作规程

文件名	质粒电转操作规程		文件编号
编写人	葛驾	审核人	批准人
编写日期		审核日期	批准日期

1.目的：制订武汉翰雄生物技术有限公司质粒电转操作规程以便规范开展质粒电转实验，获得准确、可靠的实验结果。

2.依据：文献参考与根据实验条件探索。

3.范围：适用于武汉翰雄生物技术有限公司质粒电转的操作指导。

4.职责：参与质粒电转的实验人员对此规程的实施负责。

5.内容：

5.1 设备及主要试剂

5.1.1 设备：

5.1.1.1 Gene Pulser Xcell 厂家：Bio-Rad 序列号：617BR11056

5.1.1.2 Gene Pulser Cuvette 厂家：Bio-Rad 货号：165-2088 规格：4mm

5.1.1.3 移液20-200ul 厂家：大龙（国产）编号：YE3K017366

5.1.1.4 移液100-1000ul 厂家：大龙（国产）编号：YE3K014521

5.1.1.5 STRIPETTE移液管厂家：CORNING COSTAR 规格：5ml

塑化

5.1.1.6 1.5ml EP管厂家：AXYGEN 编号：311-08-051

5.1.1.7 25cm2 Cell Culture Flask 厂家：CORNING COSTAR 货号：430639

5.1.1.8 Acrodisc Syringe Filters 厂家：Pall Corporation 批号：12491302 规格：直径25mm 0.2μm

5.1.1.9 超净工作台

5.1.2 试剂：

无水乙醇（0.2μm过滤）批号：21060801

3M乙酸钠（0.2μm过滤）批号：21060504

70%乙醇（0.2μm过滤）批号：20170111

灭菌注射用水厂家：裕松源药业批号：2016060102 规格：5ml

质粒(以pcEFGP为例)溶液批号： 20161222 浓度： 416ug/ml 体积： 1ml

CHO-K1细胞批号： 20170111 密度： 2.1x10^6/ml 体积： 5ml

CD OptiCHO培养基厂家：Gibco REF：12681-011 Lot.：1789865

5.2 实验过程(以质粒pcEFGP电转为例古典主义时期)

5.2.1 质粒pcEFGP的准备：

5.2.1.1 取已提取好的质粒pcEFGP溶液（20161222，416ug/ml,1ml）分装至2只EP管中，500ul/管。

5.2.1.2 每管加入2倍体积的无水乙醇（1ml）、1/10体积乙酸钠，混匀后置于4℃冰箱过夜沉淀。

5.2.1.3 次日取过夜沉淀的两pcEFGP，9500g，离心30min。

5.2.1.4 弃上清，每管加入500ul，70%的乙醇，震荡混匀后，9500g，离心5min。

5.2.1.5 弃上清，金属浴中55℃烘干20min。

5.2.1.6 每管加150ul的无菌注射用水溶解，混匀后用超微量紫外分光光度计测浓度。

5.2.1.7 测得结果：

夜焰

	C（ug/ml）	A260/280	A260/230	标签
pcEFGP-1	slamball1162	1.91	2.26	pcEFGP-1，乙醇沉淀，1162ug/ml，20170110
pcEFGP-2	1087	1.90	2.29	pcEFGP-2，乙醇沉淀，1087ug/ml，20170110

备注：以上操作皆于超净工作台完成。

唐县理想中学5.2.2 电转前准备：

5.2.2.1 把相关实验用品放入超净工作台，紫外灭菌30min。

5.2.2.2 准备CD OptiCHO培养基（含&不含6mM Gln）适量。

5.2.3 电转操作：

5.2.3.1 先取样计数得 CHO-K1细胞浓度为2.1x10^6/ml，再取适量CHO-K1细胞200g转速，离心5min。

5.2.3.2 弃上清，加入不含Gln 的CD OptiCHO培养基5ml，200g，离心5min。

5.2.3.3 重复上一步骤5.2.3.2。

5.2.3.4 弃上清，加入2ml不含Gln 的CD OptiCHO培养基，重悬计数。

5.2.3.5 根据计数结果，调整细胞悬液浓度为5x10^6/ml。

5.2.3.6 取800ul细胞悬液于一EP管内，加入50ug（43ul）质粒pcEFGP-1，充分混匀后，室温静置15min。同时将电击杯放入4℃冰箱预冷15min。

5.2.3.7 将细胞与质粒混悬液加入电击杯中，设置电转仪参数（指数波300V，900uF，22.5ms）进行电转。

5.2.3.8 将电转后细胞与质粒混悬液上产生的泡沫及成团死细胞吸除后，迅速转至5ml含Gln 的CD OptiCHO培养基中。

5.2.3.9 放37℃，5%CO2 培养箱中孵育12--14天并观察细胞活性。

质粒	质粒浓度	质粒取样量	细胞	细胞密度	牦牛骨取样量	电转条件
pcEFGP	1162ug/ml	50ug(42ul)	CHO-K1	5x10^6/ml	800ul	指数波300V，900uF，22.5ms