下面是实验流程和结果：
一．感受态细胞的制备( CaCl2 法)
实验前的准备工作： 检查准备无菌的试剂：0.1MCaCl（应提前预冷）、 含10%甘油的0.1MCaCl、 无抗生素的LB. 1.5ml离心管 50ml离心管（6-12个）、 200ul与1ml尖（各1盒）。
1、挑DH5a单克隆菌落至3ml无抗生素的LB中，37℃摇床培养过夜（在15ml离心管中进行）。
2、1:20-50扩大培养至250ml培养体系至OD600为0.6-0.8（约3小时）
3、将菌液移入冰水物后开超净台紫外，打开离心机使其预冷， 30分钟后分装至50ml离心管中，然后于英国资本主义革命4℃下5000rpm离心5分钟；
4、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，不能倒掉沉淀）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻用尖吹动沉淀使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下5000rpm离心5五星电器加盟
分钟（将两管合并至1管） 5、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻用尖吹动管底使细胞完全悬浮, 4℃下5000rpm离心5分钟；
6、弃去上清，加入15ml预冷含10%甘油的0.1MCaCl，轻轻悬浮细胞，将感受态细胞悬液分装成若干份，每份50μl。
7、用液氮速冻，将感受态细胞置于-80℃保存。
透析器注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
全过程要再冰上操作，及无菌操作！
二．T-载体连接全过程及转化
第一步：PCR扩增目的基因及纯化
PCR扩增：
1. PCR反应体系： 在PCR板中进行
无菌水 1060ul
Buffer 130ul
dNTP 20ul
酶 25ul
引物1 20ul
引物2 20ul
2. PCR反应条件：
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
95℃ 5min
95℃ 45s
40～60℃ 50s 循环 35次
72℃ 55s
72℃ 10min
3. PCR期间配置琼脂糖凝胶：
PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。
以下为PCR结束以后的跑胶图：
引物10
引物11A
引物11B
引物12A
引物12B
4. PCR产物回收——PCR的纯化
（1）单一PCR产物用氯仿法
● 把PCR产物转移至1.5ml的离心管，加500ul无菌水，500ul氯仿异戊醇（24:1）,混匀后10000rpm离心5-10分钟
● 转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入2倍体积（家具专卖店设计800 µL体积即可）的无水乙醇与NaAc的混合液。置冰上或-80℃冰箱30分钟以上。中小学电脑报
● 10000 rpm离心10 min。弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，离心3min,于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉。
● 置于恒温器上干燥（55℃）至无透明或无乙醇气味。
● 加入40 µL 无菌水溶解沉淀备用,在-20摄氏度保存。
第二步：T-载体连接和转化
1. 在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：
注：T-载体试剂盒开封前要向pMD18-T Vector 管中加入25 ul 无菌水，同时再管上面做标记。
pMD18-T Vector 1.0 ul
新中超客栈2015
外源DNA 1.5 ul
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议