质粒基因组测序及比较基因组方案

一、项目背景

质粒在细菌遗传物质中属于比较活跃的成分，部分细菌通过质粒上的部分基因来实现抗性或致病等生物学功能。同时，也有部分物种间的基因交流也是通过质粒完成的。研究质粒基因组，可以为细菌间快速进化、环境适应性及平行基因转移等领域提供切入点。

本方案的目的，就是通过多个质粒的测序及比较分析，解析多个物种之间质粒在基因结构层面的差异。

二、实验设计深圳职业技术学院图书馆

2.1 质粒DNA提取

建议按照文献方法，使用Qiagen试剂盒提取，保证质粒的质量和纯度。本步骤由老师完成。

2.2 文库构建

将质粒DNA分别打断成500bp及5k长度的DNA片段，分别用于构建小片段文库和Mate-pair文库。

2.3 上机测序人大释法

采用HiSeq2500平台，PE125测序，每个文库保证至少1G Raw data。

三、基因组拼接及注释

3.1 数据质控

对原始数据进行质控，去除低质量数据，具体原则如下：

1) 正常GC(35%-65%)物种：去除质量值≤20的碱基数达到一定程度的reads（默认40%）；异常GC物种：去除质量值≤2的碱基数达到一定程度的reads（默认20%）；

2) 去除含N的碱基数目总和达到一定比例的reads（默认10%）；

3) 去除adapter污染（默认adapter序列与read序列有15 bp的overlap）；

4) 去除duplication污染。

在过滤低质量数据的基础上，要将reads比对至质粒宿主的染体基因组上，到来自细菌染体的序列，并将这些序列移除，避免染体序列对拼接带来的干扰。

3.2 数据拼接

使用SOAPdenovo短序列组装软件对Clean Data进行组装，经多次调整参数后获得最优组装结果；然后reads将比对回组装获得的Contig上，再根据reads的paired-end 和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化。

软件：SOAPdenovo；版本：2.04

相关网站：sourceforge/projects/soapdenovo2/files/SOAPdenovo2/

对于质粒，我们利用小片段文库，可以得到质粒的绝大部分区域序列，剩余区域可以通过PCR walking的方式补充完整。

我们也提供基因组圈图绘制服务，如文献中的展示形式：大气气溶胶

3.3 基因组成分分析

使用GeneMarkS软件进行编码基因预测，通过RepeatMasker软件进行分散重复序列预测，通过TRF软件预测DNA序列中的串联重复序列。

软件：GeneMarkS；版本：4.6b