实验名称 | |
实验日期 | | 实验地点鲸教学设计 | |
合作者 | | 指导老师 | |
评分 | | 教师签名 | | 批改日期 | |
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格式要求：正文请统一用：；数字、英文用Times New Roman；标题用：黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜标出。不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的
4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
二、实验原理
在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外〔缓冲液中〕复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反响步骤为：
A.变性：加热反响系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温〔35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右〕，与模板DNA互补退火形成局部双链。 C.延伸：溶液反响温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
(1)碱裂解法：
染体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：
A.高碱性条件下，染体DNA和质粒DNA均变性；
B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2)离心层析柱：
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；
B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析〔紫外分光光度法〕：2009年12月四级真题
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；
B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰
蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰
碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰
C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度；
A260/A280=1.8 DNA纯洁
A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质〔芳香族〕或酚类物质
A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切鉴定：
限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的根本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳：
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).
三、：以流程图示意
〔一〕实验材料：
1.PCR
仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样、灭菌的薄壁离心管
材料：菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物
2. 质粒DNA的提取与制备
仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样、离心管
材料：溶液 P1〔S1〕、溶液P2 (S2〕、溶液P3〔S3〕、去蛋白液PE〔W1〕、漂洗液WB〔W2〕、洗脱液EB〔Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
3. 质粒DNA的定量〔紫外分光光度法〕
仪器：比杯、紫外分光光度计、微量加样
材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ
4.质粒DNA的酶切鉴定
仪器：1.5ml的EP管、微量加样
材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul)
5.琼脂糖凝胶电泳
仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统
Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液
（二）
1.实验流程：
简述实验内容流程，PCR操作步骤
↓
煮菌，PCR〔PCR程序最后设4℃保温〕
↓PCR仪运行约2小时
↓学习PCR原理、质粒DNA提取和酶切原理
北京汉铭质粒DNA提取〔约1小时〕
↓
酶切操作
↓保温约1~2小时
↓学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理
紫外检测定量
↓
电泳上样〔样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker〕
↓电泳仪运行约30分钟
观察电泳结果、记录、拍照、保存
天宝系2.实验步骤
1〕PCR反响
①菌体煮沸10分钟，冷冻，室温下解冻后离心，取上清液。
②取PCR反响管，用加样参加以下各试剂。
试剂 体积 |
灭菌去离子水 4.5ul 2*Premix Tap 12.5ul 引物1-SO100 (10 mol/L) 1.5ul 引物2-SO101 (10 mol/L) 1.5ul 菌液 5ul 总体积 25ul |
|
注意：如配好的反响液较多沾到管壁上，可将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液集中于管底，然后将反响管放到基因扩增仪(PCR仪)上 。
③按照以下顺序操作PCR仪进行基因扩增
ⅰ、94℃预变性5分钟后开始以下循环；
ⅱ、94℃、30 秒；
征服者1453ⅲ、 55℃ 、30 秒 ；
ⅳ、72℃ 1 分钟；
ⅴ、25个循环
ⅵ、72℃ 5 分钟；
ⅶ、4 ℃ 保温。
实验过程约1小时30分钟.
2）质粒DNA提取与定量：
步骤 | 操作流程 |
① | 取1.5ml培养物参加Eppendorf管中 |
| 全面整顿 ② | 13000rpm离心1min，弃上清液 |
③ | 参加250μl溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮 |
④ | 参加250μl溶液S2，颠倒4～6次混匀〔不要剧烈振荡〕，直到溶液变得清亮 |
⑤ | 参加350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液〔700μl 〕。 |
⑥ | 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。 |
⑦ | 参加500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液 |
⑧ | 向吸附柱中参加700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液 |
⑨ | 重复步骤8一次 |
⑩ | 空柱13000rpm离心1min，然后开盖室温放置3min，使残留乙醇挥发 |
11 | 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加30μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， 保存备用。 |
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