质粒构建流程(总12页)
质粒构建流程
一、引物设计
2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）西方音乐史论文选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取
1. RNA提取
试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）
准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套
操作步骤：
1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）
5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀
6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μ数字光纤直放站>咸阳偏转集团公司l去蛋白液RE，12000rpm离心45s
8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
9）弃废液，重套收集管，加500上海电视大学教学平台μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min
11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min
12）4℃，12000rpm离心60s
13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
14）-20℃保存
2. RNA反转录
试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）
准备：冰盒， 取出解冻， 为酶不可取出，预冷离心管
操作步骤：
1）基因组DNA去除（10μl体系）
5×gDNA eraser buffer 2μ体形测试l
gDNA eraser 1μl
Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)
RNase free water 3μl
PCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃
注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入
2）反转录反应（20μl体系）
5×primerScript buffer 2 4μl
primerScript RT enzyme mix 1μl
RT primer mix 1μl
长客股份RNase free water 4μl
1）反应液 10μl
PCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃
注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中
3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存
3. PCR扩增
高保真酶primerstar扩增，50μl体系如下：
5×PS buffer 10μl
dNTP 4μl
dH2O 32.5μl
Primerstar 0.5μl
cDNA 1μl(可变)
R-primer 1μl
F-primer 1μl
点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min
4. PCR产物纯化
1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）
试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01
将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。
转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。
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