实验目的： 上海应用技术学院教学管理信息系统
1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。
2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。
3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
实验原理：
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质
粒DNA纯度高，可直接用于酶序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在PH高达12.0的碱性溶液中，染体DNA烦人氢键断裂双螺旋结构解开而变性，共价闭环状质粒DNA的大部分氢键断裂而变性，但两条互补链不完全分开。当用PH为4.6的KAc高盐溶液调节PH至中性时，变性的质粒DNA可发生复性恢复共价闭环的超螺旋结构而溶于溶液中，而染体DNA不能复性，与不稳定大分子缠连在一起形成沉淀，通过离心与溶于溶液中的质粒DNA分离。 溶于上清液中的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液使之凝聚成沉淀。由于RNA与DNA 性质相似，乙醇沉淀DNA时也伴随着RNA的沉淀，可用RNA酶降解。质粒DNA 溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动速度可因电离子的大小，形态，电荷量的不同而有所差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因
此可用凝胶电泳法分离，鉴定和纯化DNA片段。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（EB）染直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：
（1）样品DNA分子的大小 （2）缓冲液 , （3）温度
（4）DNA分子的构象：一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。
（5）琼脂糖浓度：通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。
（6）电泳所用电场：凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNAcondesi片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 V／cm。
实验准备
实验仪器与材料：
恒温振荡培养箱，告诉冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，50ml离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，梳子，锥形瓶，离心机。
菌体：E.coliDH5a受体菌，具有Amp r标记的质粒DNA pUC19.
实验试剂及其理化作用：
LB培养液，抗生素
溶液Ⅰ（ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0）：葡萄糖增稠，使悬浮后 的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是阳离子螯合剂，抑制DNase的活性。
溶液Ⅱ （0.2M NaOH / 1% SDS）：使细胞破裂，使质粒DNA与染体DNA同时变性。
溶液Ⅲ （3M 醋酸钾 / 2M 醋酸）：这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。加醋酸中和使溶液呈中性，使变性的质粒DNA复性，但不能使染体DNA复性。
RNase酶母液飞机为什么是白 ，滨蛇床TE缓冲液 （10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)），饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
遇冷无水乙醇，70%乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker, 醋酸钠。
实验步骤
1、质粒的提取
EcoliDH5α （PUC19）→LB+AP平板划线→37℃，16-18hr→单菌落→LB+AP(80ml)→37℃,O/N→LB+AP(80ml)→37℃，4-6hr→称管重W1,约30ml菌液→10000rpm,1min→去上清，加5mlⅠ,涡旋→10000rpm,1min→去上清，吸干净→称重W2→2mlⅠ,涡旋，冰浴5min→4mlⅡ,颠倒摇匀，冰浴5min→3mlⅢ,缓慢摇匀，冰浴5min→12000rpm,10min→转上清至新管→2V冰乙醇，匀，-20℃，>30min→12000rpm,15min→去上清→2ml70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→37℃,5-10min→1mlTE溶液→2μlRNase(50μg/μl),37℃,
2、纯化及电泳
两份完全一样的500μl粗提物→加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V1）→加等体积（V1）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V2）→加等体积（V2）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V3）→加1/10V33MNaAc+2V冰乙醇→取沉淀→-20℃,30-60min→12000rpm,15min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min
→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→吸净上清→37℃,5-10min→两管25μlTE溶液→50μl/组→得纯化质粒DNA。
40ml×TAE→300ml锥形瓶→称0.4g琼脂糖→微波炉沸腾3次→50-60℃→倒板成型
取3μlDNA+1-2μl 6×loading Buffer→混匀→点样→100V，电泳，40min→EB染10min→水洗10min→紫外成像→分析
注意事项：
1， 提取过程应尽量保持低温。
注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心结束后，将离心管从离心机中取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。
2，溶液2要现用现配，以保证NaOH没有吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。
3，溶液2处理即变性时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂。
4，加上溶液2之后美图天下混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染体基因组DNA。
5，沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。
6，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
7，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。
8，制胶时要除去气泡。
9，拔梳子时要特小心，以防凝胶与支持物脱离。
10，上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
11，溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有EB的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。
实验现象及结果分析
1，W1=12.716g, W2=12.876g,菌重W2-W1=0.160g。
2，加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。
3，加入溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状无白菌体块存在。溶液Ⅱ为强碱性溶液，可以使细胞破裂，质粒DNA 和染体DNA变性。
4，加入溶液Ⅲ并离心后出现白絮状沉淀。因为山东大学学生之家溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，
使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成白絮状沉淀。
5，用饱和酚氯仿抽提是试管底出现大量白沉淀。
6，加入无水乙醇离心后离心管底出现少量的沉淀。加入ET溶液后管底沉淀物溶解。
我们组的电泳条带
图1 质粒DNA 电泳条带
1，从胶的左边开始，各条带分别是：（1）DNA marker，DL-5000（2—13）各组提取的质粒 DNA条带，（14）PUC19 ，(15)λ DNA
2，箭头所标记的是我们组的电泳条带。从上到下依次是：蛋白质，染体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒DNA带（主带），RNA带。
3，用我们组实验所得的电泳条带与第14条带，即标准的PUC19带型和DNA marker比较可以看出，我们提取到超螺旋质粒DNA条带清晰含量较多。开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量染体DNA及线形和环状DNA. 蛋白质带较浅,说明大部分蛋白质杂质已被抽提掉。RNA条带较浅，说明RNA 含量并不多，大部分RNA被RNase降解除去。
我们组本次实验中所提取的质粒DNA，与100ng/ul的纯p UC19质粒相比较,含量大约有200—300ng/ul。蛋白质,DNA杂带，RNA等杂志相对较少。说明我们虽然在提取过程中存在一些失误，在去上清过程中没有用移液器吸出而是直接倒掉留下了较多的杂志，使得粗
提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质杂质，但是经过纯化过程已经把大部分的蛋白质杂质抽提掉除去。
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