陶然经典
前言：质粒(plasmid)为细菌胞浆中独立于染体外的遗传单位，它能自主复制。质粒以环状双链DNA形式存在，分子链末端以共价键与各自的另一粘末端相结合，呈闭合环或共价闭合环(covaiently closed circle，ccc)，如果在提取过程中受损，部分质粒的ccc可转变为开环(open circle，oc)，或线形(L)结构。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。摘要：本文对国内外报道的弧菌中的质粒、降解质粒、稀有放线菌质粒及目前对于线性质粒的研究进展进行综合叙述。通过对于这些特殊质粒的研究进展分析，从中得到重要信息以运用于基因工程技术和分子生物学技术及发酵生产和环境工程，而造福全人类。 一、弧菌中质粒生物学特性研究
弧菌中质粒的生物学特性质粒DNA只占正常细菌DNA的5%以下，在一般情况下，对宿主细菌的生存不是必需的。但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生长。质粒可以编码很多重要的生物学性状，编码有性生殖的质粒称致育质粒或F质粒，编码细菌毒力的质粒称毒力质粒或Vi质粒，细菌对抗生素或重金属盐类的耐药性由R 质粒编码，一种质粒还可以同时决定几种功能。弧菌中的质粒一般具有以下几方面的功能。
1、耐药性大多数研究证明，弧菌中的质粒与菌株的耐药性存在一定的联系。由于菌
株分离的地区和年代不同，耐药谱可有一些差异，但经结合转移试验表明，相当一部分菌株的耐药性是由质粒介导的。弧菌的质粒有大有小，一般来说，耐药性往往与较大分子量的质粒有关，并且往往决定一种以上的抗性。
2、致病性弧菌的致病因素包括毒素和定居因子。毒素包括肠毒素(CT)、zot、ace、溶血素以及志贺样毒素等；定居因子包括脂多糖、毒素协同调节菌毛(TcpA)、血凝素等。人们在研究弧菌中质粒的同时，也考虑到了质粒与菌株致病性的关系。
3、小结质粒作为染体外的一种遗传因子，普遍存在于真核和原核生物细胞中，为微生物的感染致病和防治增添了分子生物学的理论基础。对弧菌中的质粒进行研究，可以帮助我们了解流行菌株之间的联系，进一步分析产毒性菌株与非产毒性菌株的遗传关系。但目前国内报导中，多数实验还停留在对弧菌的耐药谱进行分析，而对于从耐药菌株中分离质粒的报道较少。质粒图谱分析不需要特殊仪器、设备和试剂，操作简单易行，适合于广大的基层实验室。
松崖别业图卷二、降解质粒研究进展和应用前景
永远的谭嗣同到目前为止，已经发现的降解质粒有几十种，这些质粒的分子量大多在30一120kb之间，含有几十个乃至上百个基因，分别决定自主复制、接合转移、不相容性和物质降解等功能。所谓接合转移，就是不同菌株之间通过细胞接触使质粒从一个细胞传递到另外一个细胞中去。在自然界，这种转移作用不
仅可以使降解基因在细菌体中广泛扩散，促进有机废物的循环，而且有可能使降解基因通过体内重组和突变得到进化，从而获得新的降解能力。
降解质粒的应用前景
降解质粒研究对环保、化工和农作物品种改良等方面都具有实际应用价值。质粒基因编码的酶能降解许多有毒的环境污染物，例如用于防腐涂料和电力工业的多抓联苯(PcB)，用作除草荆的2,4-D和2,4,5-T，用作杀虫剂的烟碱(尼古丁)、六六六、DDT和对硫磷等。此外，某些工业和生活废水中的污染物的降解也与质粒基因有关，例如一些芳香烃、卤代烃、合成洗涤剂和尼龙寡聚体的降解都受质粒控制。通过对质粒遗传结构和环境污染物降解途径的研究，可以使我们了解什么样的化合物容易被微生物降解，用以指导农药和其它化工产品的合
成，使之有利于微生物的降解，减少对环境的污染。此外，通过质粒转移和DNA重组技术构建用于废水处理的工程菌株，也是人们加紧研究的课题。
1984年，专利文献报导了使蔡降解基因形成部分缺失的DNA片段在大肠杆菌HB101中表达，产生出有重要医用价值的产物。大肠杆菌本身能合成氨酸，操纵子中的氨酸酶基因把氨酸转变成吲哚，然后萘双加氧酶基因使吲哚转变成靛蓝。靛蓝是一种用途广泛的染料，现在用化学合成法生产。用微生物发酵法生产靛蓝，可能为靛蓝的工业化生产以及降低成本、减少污染开辟新的途径。
三、稀有放线菌质粒生物学研究进展
放线菌类是十分重要的高G+C含量的革兰阳性细菌，它们的培养形态与细菌有本质区别，大多数产生菌丝结构，包括培养基中的基质菌丝和培养基表面的气生菌丝及孢子丝。迄今已发表145个属，约2000个种，其中链霉菌属中约500个种。它们产生了大约10000种抗生素和生理活性物质，在医药、工业和农业方面具有重要的应用价值。
非链霉菌属的稀有放线菌广泛分布于各种土壤环境中，常具有独特的形态及生理特点。稀有放线菌也象链霉菌一样能够产生丰富的次生代谢产物，如拟无枝菌酸菌产生的利福霉素(rifamycin)及万古霉素(vancomycin)，游动放线菌产生的拉宁(teicoplanin)等在临床上是极为重要的抗生素。此外，许多稀有放线菌属在农业、环保和医学方面具有重要的意义，如可以进行生物固氮的弗兰克菌，具有降解有毒害化合物功能的红球菌，导致人类麻风病和结核病的分枝杆菌等。过去几十年里，放线菌的遗传学研究主要集中在链霉菌属，对放线菌其它类的遗传学研究相对较少，尤其是对它们的遗传操作体系则更少。对稀有放线菌属的生理或病理的研究迫切需要分子操作工具，所以发展稀有放线菌的遗传操作就有非常现实的意义。本文综述非链霉菌属的放线菌质粒生物学及其遗传操作体系的研究进展。
1、棒状杆菌质粒的研究现状
棒状杆菌由非致病的土壤类(Corynebacterium glutamicum，C.callunae Brevibacterium lactofermen
tum)、动物致病类(C.diphtheriae，C.xerosis)和植物致病类(C.nebraskense，C.michiganense)组成。非致病的土壤棒状杆菌在工业上主要用于生产氨基酸，另外的用途包括降解石腊(paraffin)生产去污剂及固醇转化等。从20世纪70年代末期开始，许多实验室进行了大量的筛选工作到了许多大小分布在1.4kb到69kb之间的质粒。通常这些菌株的大质粒上携带有抗生素耐受性基因。
2、诺卡菌质粒的研究现状
诺卡菌作为好气的放线菌是引起人体感染的病原菌。但是对它的质粒生物学性质研究并不多。Kirby等于1985年第一次从诺卡菌Nocardia corallina中分离到2.7kb的环型质粒pKU100。之后，诺卡菌质粒的工作停滞不前，许多诺卡菌的基因都可在链霉菌中进行表达。Madon等利用地中海拟无枝菌酸菌(Amcolatopsis mediterranei)质粒pMAE100发展出能在诺卡菌中复制的载体pMAE123。最近Liu等在N.italica中发现环型质粒pNI100，并克隆了该质粒的复制起始区，该区域包含一个编码396个氨基酸。
3、红球菌质粒的研究现状
在过去20年里，红球菌作为与环境相关的微生物受到越来越多的关注。它们可以降解许多环境污染物，如酚类物质、杀虫剂、除草剂、丙稀酰胺、苯胺、卤化烷烃等有害物质。目前从红球菌中分离到许多环型质粒，这些质粒按复制子的类型可分为两种：其一，以theta 方式复制的质粒，如pRE2895。该质粒编码RepA和RepB与ColE2型质粒的复制蛋白具有相同的特点，故推测其具有theta
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方式的复制机制。目前利用pRE2895的repAB构建了表达质粒pTip；其二，以滚环方式复制的质粒，如R.erythropolis DSM8424的pRE8424。它有一个单链起始区和一个双链起始区，这是典型的滚环复制单元。对单链起始区的突变分析发现单链中间体在体内积累，这是因为单链不能及时转化成双链引起的。以pRE8424复制区构建
的表达质粒能与以pRE2895为基础的质粒同时存在细菌体内，表明它们属于不同的不相容。
4、弗兰克菌质粒的研究现状
在弗兰克菌中已发现多个环型质粒，大小从7kb到190kb。目前已完成了来自菌株ArI3的质粒pFQ31和菌株CpI1的pFQ11以及pFQ12的测序工作。22.4kb的pFQ12有超过50个开放阅读框(ORF)，9个有转录活性。pFQ31有17个ORF，pFQ11有4个，pFQ11与pFQ31有大约99.7%的同源性。在3个质粒上都发现了质粒分配蛋白基因，如pFQ31的parFA、pFQ11的ORF3编码类似假单胞菌Pseudomonas alcaligenes ParA的蛋白，pFQ12含有一个蛋白类似芽孢杆菌B.subtilis的SpoJ。这些基因的编码产物使质粒能在子细胞中稳定存在。同时还发现与类似链霉菌(S.ambofaciens)中接合转移与整合性质粒pSAM2 KorSA的蛋白。根据ptrFA和repFA之间的DNA结构域推测质粒pFQ31的复制起始区位于其间，该区域序列具有类似重复子(iteron)的序列，这些结构通常在以theta方式复制质粒的复制区中存在，repFA编码复制起始蛋白Rep。pFQ12有两个开放阅读框(ORF3与ORF6)可能与质粒的转移有关。
5、小单孢菌质粒的研究现状
小单孢菌(Micromonospora)是多种重要抗生素的产生菌，其遗传操作主要依赖于噬菌体构建的载体。Parag等首先报道从西索米星(sisomicin)产生菌M.inyioensis分离到环型质粒。随后Oshida报道从M.zionensis NRRL5466(西索米星产生菌)中到高拷贝质粒pMZ1(9.9kb)，从M.rosaria NRRL3718(罗沙米星产生菌)发现53.5kb质粒pMR1和11.0kb小质粒pMR2。Hasegawa等利用小单孢菌的质粒复制子构建了一系列载体pMO116、pMO126、pMO133、pMO136和pMO217。Vukov等利用pMZ2的复制区构建了接合转移载体pMZS25和pMZS34。
6、前景展望
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稀有放线菌产生的抗生素种类占所有放线菌产抗生素的三分之一，随着对稀有放线菌环型与线型质粒被发现，越来越多的克隆或表达载体被构建，可以为深入研究稀有放线菌的遗传特征提供更多的帮助，也为有效利用微生物资源提供了有力的工具。
四、微生物线形质粒的研究进展
通常，丝状真菌的线形质粒只分布于线粒体中，细菌和酵母的线形质粒位于细胞质中，但也有少数例外，如在克鲁弗利氏毕赤氏酵母及黑迪氏毕赤氏酵母中发现的 DGI%都位于线粒体中。细菌中的线形
质粒还使其寄主具有一些利于生存的表型特点，如细菌抗生素的合成、对生物异源体的降解、重金属的抗性等。多数真菌的线形质粒没有明显的表现型，只有少数例外，如乳酸克鲁维酵母的嗜杀表型与线形质粒有关；粗糙脉孢菌和四孢柄孢壳中的线形质粒分别使寄主具有衰老和长寿的特点。线形质粒除具有特殊的线形结构外，与环形质粒一样，也具有自主复制的生物学特性。同时还发现，线形质粒作为一类新型的基因工程载体，在克隆带回文结构的DNA片断时比环形质粒具有更多的优点。
虽然，线形质粒发现得较晚，但也和环形质粒一样，具有一定的表型和生理功能，根据其所带基因以及赋予宿主细胞的特点可将线形质粒分为以下几种。
1、合成作用
2、降解作用对一些特殊物质的降解利用是某些细菌的重要特性，如对苯酚、杀虫剂、丙烯酰胺、苯胺、卤化烷等物质的降解。研究发现，分解这些化合物的酶系常和线形质粒有关，如来自自养黄杆菌Py2.降解过程一般是在线形质粒编码产物与染体基因编码产物共同作用下才完成的。
3、自养作用目前还发现，线形质粒赋予某些放线菌自养生长的能力。如混浊红球菌能在作为唯一能量来源的条件下自养生长，并能转化成非自养菌株和其它各种异养型。这种能力与两个270kb左右的线形质粒pHG201和pHG205有关。
4、编码主要表面蛋白疏螺旋体(barrelia)是引起人类回归热的重要病原菌。研究发现，位于布氏疏螺旋体一个线形质粒上的一对基因ospA和ospB编码细菌主要表面蛋白，该基因的复制由另一个质粒编码的表达信号控制。
5、嗜杀作用 1963年，Bevan和Makower发现某些酿酒酵母中可以产生毒素杀死其它酵母（称为嗜杀毒素）。目前，已分离出很多与嗜杀性状有关的突变株，发现嗜杀表型的确定与许多染体基因和线形质粒基因有关。近年来，随着对它们功能的了解，酵母线形质粒将可能作为载体成为酵母转化系统中的一个有用的工具。
6、衰老和长寿作用目前还发现，存在于脉孢菌中的线形质粒Maranhar和Kalilo可以控制寄主的衰老过程。原因是线形质粒整合到线粒体DNA(mtDNA)中，使缺失的mtDNA分子积累所致；相反，在四孢柄孢壳中发现的另一种线形质粒，却赋予寄主长寿的表型。长寿是线形质粒穿越细胞核，整合到寄主染体的特定区域中形成的。
标识符7、小结一些线形质粒具有作为基因工程优良载体的特点，如嗜杀线形质粒pGKL1和pGKL2，位于细胞质中，具独立的复制、转录系统，广泛的寄主范围，稳定、高拷贝等。目前，在越来越多的微生物中发现线形质粒，其不同于环形质粒的结构特点及特殊的复制方式展示了丰富的生物多样性；而且，从结构和生物学特性分析，有些线形质粒载体具有环形质粒不可替代的优点。从基因功能分析，有些
大型线形质粒还携带微生物的致病基因或抗生素基因，这些基因有可能成为基因工程研究与开发的重要基因来源。经过优化的线形质粒还非常有希望成为基因工程中有用的载体。
结语：最近十年来，由于分子生物学实验方法的迅速发展，特别是DNA序列分析和重组DNA技术的日臻完善，极大地促进了质粒的研究。随着越来越多的质粒被发现，及其所具有的一些特殊功能作用的研究进展，势必对人类生活产生巨大的影响。
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