氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力
一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内中国药典2005版
，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 本反应产物不要闭上眼睛
H2O2 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡ 二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
海滨锦葵叶片｡
(二)仪器设备
高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯(反应试管处照度为4000lx)，试管或指形管数支｡
(三)试剂
(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)｡ (2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液 称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml｡
(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液 称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存｡
(4)100µmol/L EDTA-Na2溶液 称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml｡
(5)20 µmol/L核黄素溶液 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存｡
三、实验步骤
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1、酶液提取 取一定部位的植物叶片(视需要定，去叶脉)0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为精彩极了和糟糕透了教学设计5ml｡取1.5-2ml于4000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
2、显反应 取5ml指形管(要求透明度好)4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液:
各溶液显反应用量：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。]
试剂名称 | 用量（mL） | 终浓度（比时） |
0.05mol/L磷酸缓冲液 | 1.5 | |
130mmol/L Met溶液 | 0.3 | 13mmol/L |
750µmol/L NBT溶液 | 0.3 | 75µmol/L |
100µmol/L EDTA-Na2溶液 | 0.3 | 10µmol/L |
20 µmol/L核黄素溶液 | 0.3 | 2.0µmol/L |
麦克斯韦方程组酶液 | 0.05 | 2支对照管以缓冲液代替酶液 |
蒸馏水 | 0.25 | |
总体积 | 3.0 | |
| | |
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长)｡
3、SOD活性测定
至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度｡
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性：化工工艺设计手册
式中：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示(U/g)；ACK 为照光对照管的吸光度;AE 为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml)；Vt 为测定时样品用量(ml);W为样鲜重(g)｡
注意事项
1.核黄素产生，NBT 还原为蓝的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。
2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。
3.测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。
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