SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

氮蓝四唑法

一、原理

智投分析超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：

反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝的甲腙，后者在560nm房地产平面广告设计处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL、20μL、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux或Lx)

(三)试剂

(1) 0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定溶至100mL。

(3)750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定溶至100mL，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定溶1000mL。

(5)20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定溶到1000mL，避光保存。

三、试验步骤

(一)酶液的提取

(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5mL。取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

(二)显反应

取5mL的试管(要求透明度好)若干，有对照、处理。按下表加样：

李钟瑞

试剂(酶)	用量/mL	夏天也是好天气终浓度/比时
0.05mol/L磷酸缓冲液网易日记	1.5
130mmol/Lmet溶液	0.3	13mmol/L
750μmol/LNBT溶液	0.3	75μmol/L
100μmol/L EDTA-Na2液	0.3	10μmol/L
20μmol/L核黄素	0.3	2.0μmol/L
共享酶液	0.05	对照液用缓冲液
蒸馏水	0.25
总体积	3.0