红花红素酶法转化的研究

红花红素酶法转化的研究 8新疆中医药2001年第l9卷第4期(总第76期)

红花红素酶法转化的研究

新疆西部加斯特药业有限公司(s3ooo2)安熙强顾政一

摘要红花氧化酶的定性实验表明.氧化酶主要存在于新鲜红花花瓣和花粉中,得花粉破壁

后提取舟离了红花氧化酶.经己醇沉淀.Sephadex拄层析,案外桂测.酶洗脱液的蛋白峰和活性峰一

致,经淀粉凝胶电脉.得到较单一的电赫,酶法转化红素的初步实验表明,转化后的红威协可能是

红花豇素红素的黄前驱精可能存在于除去水溶性黄素的红花中. 关t词红花红花红素红花花粉氧化酶多酚氧化酶过氧化物酶红花(Carthamtmtincto~L.)系菊科(c0mpo~tae) 红花属(Caxthamus)一年生草本植物,红花花粉(s

flowerD0llen)呈园球形或椭园形,直径64—80pro,外

壁有短刺及疣状雕纹,并有3个发芽孔.

红花是中医传统重蔓的活血化瘀药,是一种妇

半乳糖科良药,又是无然素的原料.红花红素作为无然

平痛新素的生产为社会所关注,但因其含量较低.价格

高,应用受到限制.自古以来.红花品质以红为优,

如何提高红花品质及红素古量戚为黄改之.因此,

古夸中外学者所重视的课题.《本草求真》记载:红

花辛苦而温,红人血,为通癀话血蔓荆."让为有效

成份是红成份.如对红花的加工,李时珍有过这

样的论述j"清晨采花捣燕.以承淘,布袋绞去黄汁叉

孔府宴酒破产拍卖

捣,以酸粟米泔清又淘,又绞墟去汁.以青蒿覆一宿,

晒干,或捏成薄饼,阴干收之.人药搓碎用."红花

饼,板红花均为除去水藩性黄素后作药用1952

ada发现在红花新鲜黄花瓣中有一种黄结年W

晶,是一种前驱物,艟氧化为红的红花甙.1955年 Saimoko6yeme和He.t~i报道,在红花的花瓣中有多酚氧化酶及过氧化物酶,能使前驱物转化为红花稚. l9印年Se~hadri等认为红花红素是醌式红花甙(红 )是由前驱物(黄)氧化生成的.州米达夫提到红素的制造系将解花充分承洗,除去水溶性黄素,用脚踏揉温存一瘦堆积发酵遂将红花甙(黄素)进行氧化,从而生成醌式红花甙(红素)目前国内红素提取工艺也采用发酵,氧化来提高红素收率.民间红花收获后均堆集在阴凉处,使之充分转红,提高红花质量李时珍以青蒿覆一宿"也是利用氧化酶使花瓣转红.由此可见.红花氧化酶能将前驱物(黄)转化为红素(红),红花在生长过

病因学

花瓣由黄新渐变为红.就是这些成份间的程中.

变化所致.进一步研究发现:许多品种的红花花瓣均在完成受粉后,才逐新变红.因此.红花氧化酶也可能存在于红花花粉中.经测定红花花粉所古的氧化酶较新鲜花瓣高.我们从红花花粉中提取分离了红花过氧化物酶,并用过氧化物酶作了红素转化的初步研究,介绍l如下.

1实簦都分

1.1氧化酶定性实验

1.1.1试剂及针剂邻苯二酚,焦性没食子酸,磷酸盐,乌,均为分析纯.

1.1.2实验原理

明

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I.I.3酶藏的提取将处理好的样品置于研体中, 加人少量冷冻后的磷酸缓冲液,研磨成浆欹,用缓冲液洗人25?L量筒中,加缓冲藏至25mL'充分搅匀, 在球水挎中授提半小时,过滤,持液备用. I.I.4实验方法多酚氧化酶的鉴定:将5mL酶提取液加人试管中,加邻苯二酚溶液1O滴,充分播匀后,在37?恒捏水潜中保温,摇动观察颤变化.同时做试剂和无活性酶时照.

过氧化物酶的鉴定:将3mL酶提取液加人试管中,再加焦性没食子酸藏3mL,同时做无活性酶,过氧化茸空白对照,观察颤及沉淀的'出现. 1.2过氧化韧的挺琅分离

1.2.1一实驻材料破壁后红花花粉,乙醇,Seph丑d既 G一150,uv一2OO型紫外分光光度计. 1.2.2实验方法(1)将破壁后的花粉加水授提, 加人95%的乙醇使吉醇量达8O%离心.将沉淀加水

带謦.过媾君,再加95%乙醇使古醇量达85%,离 .沉淀加蒸馏承溶解备用(酶粗提取藏).(2) SephmdexG一150柱层析,将酶粗提取藏反复上柱纯化,用蒸馏水洗脱.收集洗脱瘟份.洗脱液管1,2, 3,4……3o管在2$0nm用uv一00型荣外分光光度计测嗳收虔.拣后再在每一冼脱臂液.各加

,一

新疆中医药2001年第19卷第4期(总第76期)9 03%焦性没食子酸液5滴,摇匀在470ran铡驳收度.氧化酶蛋白蜂与酶活性峰一致(见图1). Fr~tioanumb

囤ICC.,0DfromSP帅pILad雌G150

1.3过氧化物酶淀粉胶电泳

1.3.1试剂和仪器马锋薯淀粉,,乙醇;缓冲

液A:0.2M硼酸一N丑oH缓冲蒗pH8,3;缓冲液B: 02Ml~s一柠檬酸缓冲液pH8.3;盐酸丙酮承解液; 过氧化暂酶显液;中压电泳恒—9型,稳压电源,电泳槽.

1.3.2实验方法(1j淀糖永解:100mL承解}茛中加人50g淀粉.37?恒温水措中搅拌30分神,加NaAC 终止反应,然后抽气过l癌,蒸糟水冲洗,再用丙酮脱水,干燥备用.(2){斟胶:将水解过的蕹粉教人A,B 混合液中,加热搅拌待胶完全透明后越热髑人胶槽, 使胶表面光滑,冷却1小时可用.(3)样品:由s.t,h. adexG一150纯化的酶液.(4)电泳及显在脏板上垂直向下坷一小口,将剪戚小圆片的滤纸蘸上样品灌,插人切口中,用蜡纸做电泳析,在冰箱中电泳. 电泳基件:I=80?I^,V?120V,T(时问)=3,5

小时.

浦东实践的现实意义

电诔缓冲亭茛:0.2蹦礤酸一Na0H埋冲蒗pH8.3. 显乜:电器结束嚣,将赃片放人显液中,加数滴过氧化氢.待蓝的谱带清晰,立即放人50%乙醇中固定.氧化酶带向正极方向移动(见图2). 1.4红素转化的韧步试验

1.4.1试验材料红花缸靠,红花黄素f新疆北雇红花素厂产品),红花提取液t不舍红素),6o%乙醇红素提取渡用吸附剂腺尽红素(板层检查无红斑点).红素对照品:总红素经柱层析分离纯化,得红素纯品,结构与C~tlmraln相同.硅胶HF扳:购得.硅胶G板:自制.

dsp解密1.4.2实验方法(1)红花黄素加水涪解,加入 CathodeAnadc

田2Staeh曾e1etmph叫e出p【协m0fPOD 5mL酶液,分别置室温和不同温度放置.经板层检查均无红斑点.(2)红花提取藏:加5mL酶液,室温自然放置.经板层检查有红斑点并与红素对照品斑点Rf值一致(见匿3).

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