淡水渔业，2021,51(3)：53-59 Feshwatee Fisheries 2021年5月May2021
凌晨心，张美东2，沙航2，邹-伟2，罗相忠2，梁宏伟2
(1-水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海201306；
硅酸盐学报
2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223；
3.农业农村部淡水水产种质资源重点实验室(上海海洋大学)，上海201306)
摘要：为研究低氧胁迫对'(Hypophthalmmythys nwlitrix)不同组织抗氧化酶活力及对相关基因的影响，将体重(200±12.4)g的'放置于密闭水箱中，通过鱼体自发耗氧进行低氧处理，在常氧［溶氧为(6.42±0.3)mg/L］、浮头［溶氧为(0.76±0.03)mg/L］、半窒息［溶氧为(0.58±0.06)mg/L］和窒息［溶氧为(0.27±0.06)mg/ L］时分析血液、鲫和肝脏组织中的抗氧化酶活性及超氧化物歧化酶基因(SODs)表达特征。结果显示：低氧胁迫过程中，血清过氧化氢酶！CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力逐渐增加，CAT活力在半窒息时显著升高，GPX无显著变化，超氧化物歧化酶！SOD)活力相比其他组均显著降低；肝脏中SOD#CAT酶活力呈先升高后下降的趋势，在窒息组时酶活力显著降低，GPX无明显变化。肝脏中Cu/Zn-SOD mRNA表达量在浮头和窒息时相比于常氧组有显著差异，”中Cu/Zn-SOD
表达量在低氧胁迫组均显著低于常氧组；Mn-SOD基因在肝脏中的相对表达量先升高后下降，在半窒息时显著降低；”中Mn-SOD在浮头时的表达量显著降低后趋于平稳。'对低氧胁迫产生氧化应激，但其可以通过自身的抗氧化系统进行调节，而当溶解氧过低时机体出现损伤，甚至死亡。
关键词：'(Hypoghthalmmythys molitrix)；低氧胁迫；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；CuZ Zn-SOD；Mn-SOD
中图分类号：S965.113文献标识码：A文章编号：1000-6907-(2021)03-0053-07
溶解氧(dissolved oxygen,DO)是影响鱼类生存和生长发育的重要环境因子。在水产养殖过程中影响水体溶解氧的因素有光照［1］、水温［2］等。水体中溶解氧水平过高或过低均会引起鱼体发生强烈的应激反应从而导致其氧化抗氧化平衡发生改变⑻，过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体中三种主要的抗氧化酶，也是反映鱼体健康与否的重要指标，其组成的抗氧化系统用来抵御低氧胁迫过程中产生的多余氧自由基。西伯利亚K(Acipenser baerii)在低氧胁迫下肝脏CAT和SOD酶活显著降低⑷；大口黑餉(MOropteno salmoides"受低氧胁迫时其肝脏的CAT和GPX活性明显升高［5］；在卵形12(Trachinotue satus-(6］、团头鲂(Megalobrama amblyceppala)(7］、黄L鱼(Pelteobagmte mylmdraco)(8］中均发现低氧胁迫能诱导抗氧化酶活性发生变化。
'(Hypophthalmicythys moHtria)，俗称白'，属鲤科'属，2019年全国养殖总产量达381.03万吨，仅次于
草鱼⑼，是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一，也是长江增殖放流的主要鱼类［10］'由于'性情急躁，应激刺激后反应强烈，易出现浮头，泛塘现象，是一种极不耐低氧的鱼类，在高密度运输、气温骤变过程中非常容易引起低氧应激、死亡等现象，造成严重经济损失’目前对'低氧相关的研究主要集中在低氧相关基因的cDNA克隆与表达变化分析等方面［11-13］，仅见胡利双(14］对低氧胁迫下'组织氧化应激指标进行了研究。本试验从酶活性和基因表达水平分析低氧胁迫对'应激的生理响应过程，研究了'对溶氧变化的适应性调节机制，为其健康养殖及耐低氧品种选育提供科学依据。
收稿日期：2020-12-11；修订日期：20218388
资助项目：国家重点研发计划(2018YFD09003)；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系；国家淡水水产种质资源库(FGRCI8537)
第一作者简介：凌晨(1995-"，女，硕士研究生，专业方向为水产动物种质资源与遗传育种°E-mat：1746099939@qq
通讯作者：梁宏伟'E-mat:
54淡水渔业2021年
1材料与方法
1.1试验鱼来源
试验用鮭取自农业农村部鮭遗传育种中心，体长为(22.1±0.8)cm，体重为(200±12-4)g，在选育车间的玻璃缸中暂养一周后，挑选外观健康，活力正常，规格相对一致的个体用于试验。
1.2实验设计及样品采集
将暂养后的鮭随机分为4组(常氧组和3个低氧胁迫实验组)，分别放入80L的透明水箱中，每组设3个平行，每箱放入10尾，总计120尾，实验水温维持在(23-0±0-53)°C。常氧组'保持正常溶氧(T,DO值为(6-42±0-3)mg/L］，试验组用保鲜膜和塑料盖密封，试验期间用溶氧仪测定各试验组水中溶氧量。其中常氧组在低氧胁迫前进行采样；浮头组［T,DO值为(0.76±0-03)mg/ L］在试验鱼全部浮头时采样；半窒息组［T2, DO值为！0.58±0-06)mg/L］在缸内半数鱼死亡时，采未死亡试验鱼作为样本；窒息组［T3,DO 值为(0.27±0-06)mg/L］在试验鱼全部死亡时采样。每组随机采5尾，采样前用150mg/L的MS-222麻醉试验鱼以降低应激反应，然后用一次性灭菌注射器在尾椎静脉采血，放入离心管中，混匀，4C下血液经3500r/min离心10min，吸取上清液制备血清，所得血清为无或是淡黄，将血清放于-20C冰箱保存备用。采血后迅速解剖鱼体，取出”、肝脏等组织用干净无菌的冻存管装样本，液氮速冻后置于-80C冰箱保存备用。
1.3酶液制备
采样时得的上清测，冻存的肝脏组织0.5g左右，按照重量体积比为1：9的比例加入9倍体积的预冷生理盐水(0.86%)，用全自动组织破碎仪制备10%的组织匀浆，冰水浴条下,2500eLmin离心10min，得上清于SOD、CAT和GPX活性的测定，所有样品在12h 内测定完毕。
1.4酶活性测定方法
酶活均使用南京建成生物有限公司试剂盒进行测定。SOD活性用黄U吟氧化酶法测定，其定义为1mg组织蛋白(1mL血清)在1mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个酶活力单位。CAT活性采用钳酸鞍显测定法，其定为1mg白(1mL清)1s分1mo 的过氧化氢！H2O2)的量为1个酶活力单位。GPX 活性采用DTNB直接法测定，其定义为1my组织蛋白(0.1mL血清)在37C反应5min，扣除非酶反应的作用，使反映体系中GSH浓度降低1mol/L 为一个酶活力单位。
1.5总RNA提取及实时荧光定量PCR检测
取0.1y'肝脏、”组织按照t/zo1法提取总RNA，用超微量分光光度计NP80(德虱IMPLEN)测定RNA在260-280nm下吸光光度比值(OD^m OD^^)»RNA的质量、纯度以及浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。使用HiScept cDNA Synthesis Kit试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)将其反转录合成cDNA, -20C保存备用。使用本课题已发表的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因引物序列，以!-actio为内参基因(表1)，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，实时荧光定量PCR反应体系20'L：2x ChamQ
Universal SYBR qPCR Master Mio10-0'L，上、下游引物各0.4'L,cDNA模板0.8'L, ddH2O8.4'L。扩增程序：95C预变性5min,95 C15s,60C30s,72C32s，进行40个循环；95C15s、60C1min、95C15s。以2一法换算目的基因的相对表达量。
Cu/Zn-SOD-F5'-CCAACCGATAGTGAAAGACACGT-3'177 Cu/Zn-SOD-R5'-CTCATTGCCTCCCTTCCCCAAGT-3'
表1实时荧光定量PCR扩增引物序列
Tab1Primer sequences used in the real一hme
fuorescencc quantitative PCR
引物名称物
扩增长
度/bp !-actin-F5'-GAACCCCAAAGCCAACAG-3'446 !-actin-R5'-CAGAGTCCATCACGATACCAG-3'
Mn-SOD-F5'-TGTGACGACCCAAGTCTCCCTT-3'112 Mn-SOD-R5'-CTGTGGCTCTCCTCCACCATTC-3'
1.6数据处理和统计分析
实验数据采用Excel2013和SPSS22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，并以SPSS22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和
第3期凌 晨等：低氧胁迫对'抗氧化酶活性及SODs 基因表达的影响55
Duncan 't 多重比较'2结果
2 1低氧胁迫对G 血清抗氧化酶活性的影响
度的降低，'血清CAT 酶活性呈现
出 高 的变化，在半窒息时CAT 酶活力达到最大(12.84 ±0. 56) U/mL ，显著高于正常溶
氧、浮头和窒息时的酶活力(P<0.05)，窒息点时 酶活降至最低(图1 )&
迫过程中，血清中的
SOD 酶活在浮头至窒息的过程中 高 ，
浮头时酶活 比于 显 ， 窒 时
SOD 又显著升高随后降至最低(51.2 ±1.24) U/ mL ，与其它各点均具有显著性差异(图1 ); GPX
酶活力在整个
迫过程中呈先升高 的趋
势， 均高于正 ， 且在浮头时 GPX 酶活
达到最大值(248.35 ±28.36) U/mL ，随后一直降
低，在 个
中无显著差异(P>0.05)°
3 2 2 1 1
3
T 2
T 3
W 1)、
Z ^G O S
Tl
a
3
a -
.■
■ T
5
5
图1 低氧胁迫下鮭血清酶活性的变化
Fig. 1 Changes of serum enzymv activity undvr hypoxia stress in H cmlioia
T0表示常氧组，T1表示浮头组，T2表示半窒息组，T3表示窒息组°柱上标不同小写字母
表示差异显著(P<0. 05"，相同字母表示差异不显著(P 〉0.05)。下同。
2 . 2低氧胁迫对G 肝脏组织抗氧化酶活性的影响
随着氧浓度的降低，'肝脏SOD 、CAT # GPX
3种酶活力均呈 高 的变化趋势(图2)o
CAT 在
迫至浮头时，酶活
高且达到最
大值(43.61 ±1.79) U/mg ，相比于常氧组无明显 变化，随着溶解氧的 ，CAT 酶活 直呈降的趋势，到窒 时降至最低(29.31 ±4.30) U/
mg ，显
于正
、浮头 窒息时的酶活
力。SOD 在低氧胁迫过程中活力先升高后降低,
在浮头时酶活力达到最大(87.57 ±2. 91 ) U/mg ，
与 比无明显差异， 直呈下降趋势，窒
时显 于其 的酶活力& GPX 酶活力在
迫 中 上 下 ， 窒 时达 最
值(132.92 ±44. 62 ) U/mg ，随后在窒息组时降低
至(102. 15 ±36. 69) U/mg ，与其他各点的酶活均
无显著差异。
图2低氧胁迫下鮭
Fig. 2 Changet of livre enzyme activity undvr hypoxia stress in H.
molioia
56淡水渔业2021 年
2.3低氧胁迫对超氧化物歧化酶基因(SODs )表
的在 中，Cu/Zn-SOD 基因在整个低氧胁迫
中的
二硫化碳毒性表达量呈
高 的变化趋势,
在浮头时Cu/Zn-SOD 表达量达到最高，随后一直呈下降趋势，在窒息时显 于 ° Mn-
SOD 基因在浮头时表达量升咼，之 在半窒息时 显 于幸福交响曲
，窒 时Mn-SOD 基因的表达量又
出 高，相较于 显著性差异(图3)°在
”中，Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 基因在 时表达量最高， 度的 ， Cu VZn-SOD Mn SOD 基因在浮头时的 表达量均显
，半
窒息时Cu/Zn-SOD 基因的表达量显著上 在窒
息时下降，与其 比均有显著性差异。Mn-SOD 基因的 表达量从浮头到窒 直呈下调
趋势，与
陈迪和比均具有显著性差异。
4
2 0 8 6 4 2~ ~ ~ - o o o o O
*故<；友天
■ Cu/Zn-SOD
086
42086420
~ ~ ~ ~ ~ - o o o o ■ Cu/Zn-SOD □ Mn-SOD
*故w R X
ttn
扶
图3 低氧胁迫对鏈肝脏和鲤中Cu/Zn-SOD 、Mn-SOD 基因相对表达量的影响
Fig- 3 Effects ol hypoxia stress on the relative expression ol Cu/Zn-SOD % Mn-SOD gene in liver and gilt ol H. molifio
3讨论
3.1 G 血清和肝脏组织中抗氧化酶活力在低氧胁
迫下的变化
在低氧胁迫初期(浮头)，鮭血清CAT 和GPX
酶活力上升,SOD 酶活力显著下降，此时已经开
化应激，机体开 生抗氧化反应。随着
度的 ，在半窒息时SOD 和CAT 酶活力显 上升,GPX 酶活力下降，此时由于
迫导
致鱼体内产生大量的氧自由基，CAT 和SOD 活力
高以清除这 由基， 保护体内细胞损伤；窒息时CAT # SOD 和GPX 酶活力都发生下 降，与张勇等(15)在美洲鮒(Alosa sapifissima )中的
结果
，表明 度 '抗氧化系统的功能， 其抗氧化能 破坏体内原有的自由基代谢平衡，产生氧化损伤，使机体细胞的正常
生理功能被破坏，最
试验鱼 。肝脏中，在整个低氧胁迫过程中CAT # SOD 酶活力整体呈 下降趋势，GPX 呈上升的趋势。张志伟(16珥 在'
中低氧可抑制SOD 的产生，但在”中的
结果相反。浮头时CAT # SOD 和GPX 出现升高，
表明 平
抗氧化酶活性的升高，以清除
多余的 由基， 化应激 的危害，
与卵形1 2(17)#青田田鱼(CypPnoc caio
vae - qmghaneysg ) (18)的研究结果相吻合°随着氧浓
度的
， 中 CAT # SOD 酶活 在窒
时
显
，GPX 酶活
至与正 持平,
与团头鲂(⑼#西伯利亚K (20)在
迫后结果相
似，以 环境下大头兔脂鲤(Lepo-
rinoc macrocephaloc ) (21 肝胰脏中 SOD 活性和 CAT
活性显著降低；细鳞肥脂鲤(PiaTacOs mesopotami
cus) (22)和葛氏
(Perccottoc gleniil (23)在 胁迫下 CAT 活性和GPX 活性也显
，与
本研究结果相似。窒息点的溶氧量 鱼体的能
，难以通
高
抗氧化酶活
清除体内过量活性氧分子，最 鱼体死
°
中'血清
在
度持
中，表 出不同的抗氧化响应模式，这与陈世
(6)
的研究结果类似。
3. 2低氧胁迫对超氧化物歧化酶基因表达的影响
本研究中Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 基因在肝脏
卷积核和”组织都有表达，是由于Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 以在 能 中 (24)， 两个基
因在 ” 中的表达方式却不同。在 胁
迫过程中Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 在肝脏大量表达, 在”中表达量相对较低，说明
于
迫
第3期凌晨等：低氧胁迫对'抗氧化酶活性及SODs基因表达的影响57
的影响要比”更为敏感，这可能与不同组织执行的生理功能不同有关。肝脏作为一种重要的免疫组织，是排毒和体外生物代谢的重要器官，能够维持鱼类的稳定状态和正常生理功能。在肝脏中，Cu/ Zn-SOD和Mn-SOD的mRNA表达水平在浮头时均升高，随着氧浓度的降低Cu/Zn-SOD和Mn-SOD 的表达水平受到抑制，与SOD酶活力的变化趋势相一致。浮头时Cu/Zn-SOD Mn-SOD表达量的升高，超氧化物歧化酶活力也升高，表明SOD酶系统的抗氧化应激反应在很短的时间内就会被激活。此时低氧胁迫诱导细胞内ROS增加，SOD抗氧化酶系统则需要增加表达水平来维持细胞内的氧化应激平衡状态[25]O董国凯[26]在大鼠的研究中认为，氧自由基本身可以发挥信号转导作用，过量生成或SOD活性下降有可能触发细胞的内在代偿调节机制，激活胞浆中的基因调控蛋白，使Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量增加。在低氧胁迫后期，中SODsmRNA表达的被制，
中ROS的大量积累，细胞内氧化平衡状态被打破，从而加速了肝细胞功能的紊乱甚至丧失。”作为鱼类的主要呼吸器官，在进行新陈代谢和渗透压调节等方面具有重要的功能，同时由于”直接暴露于外部环境中，因此是对外界刺激最敏感的器官。在'”组织中，随着低氧胁迫的进行，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的mRNA表达水平在浮头时均显著降低而后持续低表达，低氧胁迫对”组织造成了一定的氧化应激损伤，导致其抗氧化系统紊乱，无法维持细胞内的氧化应激平衡状态。
4结论
低氧胁迫对'不同组织中抗氧化酶及Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达均产生显著影响。虽然'能通过自我调节抗氧化酶活力和上调SODs基因表达来抵御氧化应激反应，但在严重低氧胁迫下，氧化压了体的抗化调节能，鱼体内环境遭到破坏，组织发生损伤，自身的抗氧化防御制，最体疫能，至出现死亡现象。
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