化
工进展
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS
2019年第38卷第1期
姜恬1，冯旭东2，李岩1，李春1，2
（1北京理工大学生命学院，北京100081；2北京理工大学化学与化工学院，北京100081）
摘要：随着生物产业的发展，生物酶催化发挥着越来越重要的作用。然而，部分酶在应用过程中仍然存在诸多问题，影响了生物催化的进一步发展。本文以酶的底物特异性为切入点，回顾了酶的专一性、高效性和环保性；介绍了酶在药物合成和天然产物改性领域的应用以及所遇到的问题；综述了酶的底物特异性改造过程中各种方法的应用，包括化学修饰、非理性和理性设计。化学修饰作为一种直观的修饰方法，通过化学反应对酶分子进行改造；非理性设计是利用易错PCR 和DNA Shuffling 等手段获得底物特异性提高的突变体；理性设计是基于序列和结构信息对酶分子进行改造。本文从重塑活性口袋提高酶的 军事卫星底物特异性和重塑活性口袋改变酶促反应类型两个方面出发，详述了理性设计改变酶的底物特异性的方法，为酶的特异性改造提供借鉴。关键词：生物催化；酶设计；底物特异性；分子改造中图分类号：Q814
文献标志码：A
文章编号：1000-6613（2019）01-0606-09
The biocatalysis and enzyme modification of substrate specificity
JIANG Tian 1，FENG Xudong 2，LI Yan 1，LI Chu 1，2
yig滤波器
(1School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2School of Chemistry and Chemical
Engineering,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China)
Abstract:Enzymatic catalysis plays an increasing role in the development of bio-industry.However,there are still many problems in the application of some enzymes,which hinder the development of biocatalysis.This paper focused on the enzyme substrate specificity and reviewed th
e advantages of enzymes,such as high specificity,increased efficiency,and environmentally-friendly process.The applications of enzymes in fine chemistry and pharmaceutical synthesis were introduced.The paper also summarized the current methods used in engineering of enzyme substrate specificity,including chemical modification,irrational and rational design.Chemical reaction was a direct-viewing method applied in enzyme modification.Irrational design was often employed to obtain the better mutants with increased substrate specificity through error-prone PCR and DNA shuffling.In the rational design,enzyme engineering was based on their sequences and structures.Starting from reshaping the active pockets for increasing the substrate specificity and changing the enzymatic reaction type,this paper elaborated the methods of rational design to enhance the substrate specificity and provided a reference for future substrate specificity engineering.
Keywords:biocatalysis;design of enzyme;substrate specificity;molecular modification
特约评述
DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2018-1136
收稿日期：2018-05-31；修改稿日期：2018-08-23。基金项目：国家自然科学基金（21506011）；
国家杰出青年科学基金（21425624）。第一作者：姜恬（1993—），女，硕士研究生，研究方向为酶工程。E-mail ：jiangtiantian1002@163 。
通信作者：李春，教授，博士生导师，研究方向为生物催化与酶工程、代谢工程与合成生物学。E-mail ：lichun@bit.edu 。引用本文：姜恬，冯旭东，李岩，等.底物特异性的生物催化与酶设计改造[J].化工进展,2019,38(1):606-614.
Citation ：JIANG Tian,FENG Xudong,LI Yan,et al.The biocatalysis and enzyme modification of substrate specificity[J].Chemical Industry and Engineering Progress,2019,38(1):606-614.
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第1期姜恬等：底物特异性的生物催化与酶设计改造生物催化与转化是生物学、化学、过程工程等多门学科的交叉研究领域，其主要目标是以微生物或酶作为催化剂生产医药、化学品、能源和材料等重要产品[1]。生物催化剂的研发与获得是生物催化与转化领域的研究热点。然而，部分生物酶在实际应用过程中存在着一些问题，例如热稳定性差、底物特异性差、底物谱窄等，使得生物催化与转化技术的应用受到了极大的限制[2]。近年来，随着基因工程、蛋白质工程以及各种组学技术的快速发展，基
因操作更加方便快捷，酶分子的定向进化技术的不断改进，各种理性、非理性设计方法的产生及高通量筛选系统的开发，对现有生物催化剂的改造更加便捷，为解决生物催化剂存在的这些问题提供了的工具（图1）[3]。本文以酶的底物特异性为切入点，介绍酶的优点以及现阶段所遇到的问题，综述底物特异性的生物催化与酶设计改造过程中的方法及其应用，为酶的特异性需求提供借鉴。
1酶的特点与生物催化
生物催化是指利用酶或者细胞为催化剂来进行
催化反应，又称为生物转化。与化学催化相比，生
物酶催化具有诸多优点。1.1
酶的专一性
酶的专一性是指一种酶只能作用于一种或者一类结构相似的底物，主要有绝对专一性和相对专一性，其相对专一性使得酶分子只能催化含有特定基团或者特定化学键的反应，并且对于具有立体异构性的底物只作用于其中一种。在催化反应过程中，由于部分物质分子结构复杂且多为手性化合物，产品纯度要求较高，酶催化过程中的专一性可缓解部分化学反应特异性差的问题[4]。
1.2酶的高效性
酶与一般催化剂不同，在反应过程中酶与底物相互作用，形成过渡态中间物，然后分解为酶和产物，在这一过程中酶与底物之间形成氢键、疏水作用、静电作用等，使得过渡态复合物的能阶降低，整个反应速度加快。这一特征使得酶的催化效率比普通催化剂高108～1013倍。酶的高效性使得催化周期缩短，在研发和应用领域有良好的前景。1.3酶的环保性
酶催化过程环境友好，能够绿高效地进行催化反应[5]。药物合成方面，在抗癫痫药物普瑞巴林的研发过程中，与化学催化相比，生物酶催化可以使溶剂的使用量减少88%，Ni 催化剂减少85%，原料消耗减少85%；在糖尿病药物中间体井冈霉醇胺的研发过程中，酶催化的使用使得原料成本下降70%，能耗节省20%，纯度从10%提高到90%[6]。污水处理方面，卤醇脱卤酶、有机磷农药降解酶和过氧化物酶可用于降解工业废水和生活水体中的化学物质以及农药残留，保护自然环境。疾病方面，木聚糖酶通过典型的酸碱亲核水解反应水解饲料原料中的木聚糖，从而产生木糖或木寡糖，高度选择性促进双歧杆菌的繁殖和丁酸的产生，从而抑制沙门氏菌等厌氧菌的繁殖，减少下痢。因此，生物催化过程的广泛应用可以有效地实现节能、减排和降耗，同时获得高质量的产物，推动绿生物制造的发展[7]。
2酶催化的应用与存在的问题
2.1
酶催化在精细化工领域的应用
精细化工品类众多、附加值高，包括医药中间体和原料药、农用化学品及中间体等[8]，其中医药、农药化学品比例达32%以上，关乎环境、安全和健康。因此精细化学品的制造水平成了衡量一个国家化学工业水平的重要标志[9]。目前我国精细化工制造存在的主要问题是高端制造能力欠缺，高端品种长期依赖进口，传统精细化学品生产能耗大且物耗高，建立在“拼资源、拼能源、拼环境”基础上的传统制造方式面临危机。以生物催化剂为核心的绿生物精细化工的出现，解决了当前面临的资源、环境、健康问题，实现了产业技术的升级。生物精细化工是以生物技术为核心，融合化学工程和有机合成的原理和方法，实现医药、农药等精细化学品的高效绿生产[10]。生物催化剂的应用涉及
药物合成、天然产物改性等领域。
图1酶的底物特异性改造策略
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化工进展2019年第38卷
2.1.1在药物合成中的应用
医药行业的发展关系到国家医疗水平的发展，而药物研发的关键问题之一就是手物的合成，手性化合物通常是多种药物的中间体[11]。传统的化学合成路线需要严格的反应条件，如高温、高压、强酸、强碱等，并且选择性较差，使得手物的研发与合成效率和产量均较低。而生物催化剂由于温和的反应条件和其严格的化学、立体和区域选择性，对于手物的研发具有非常重要的推进作用。酶催化拆分的反应主要包括不对称水解反应和氧化还原反应。
现实主义法学
水解酶的结构简单、来源丰富、无需辅酶且许多已商品化，故成为目前酶催化手性拆分中使用最多的生物催化剂。氧化苯乙烯的对映异构体及其衍生物是许多药物和液晶材料的前体物质，利用重组毕赤
酵母表达系统表达来自Rhodotorula glutinis的环氧化物水解酶，能够催化R型氧化苯乙烯，最终得到光学纯度在98%以上的S型氧化苯乙烯，产率在36%[12]。经过反应条件的优化，光学纯度在98%以上的S型氧化苯乙烯的产率达到41%[13]。氯代苯乙烯（CSOs）及其对映异构体是合成一系列生物活性分子的重要前体物质，来自S.tuberosum中的环氧化物水解酶对3-CSO和4-CSO具有很高的立体选择性和互补区域选择性，该酶能够精确识别R 型和S型的CSO，最终生成相同的二醇[14]。Karboune等[15]展示了水解酶对4-CSO极高的选择性，并且能够优先水解(R)-4-CSO，生成R型的二醇。Chen等[16]利用Escherichia coli重组表达获得来自Trigonopsis Wariabilis的R型氨基酸氧化酶，以R 型氨基酸为底物，生成具有99.9%选择性的S型氨基酸。目前已有诸多研究者聚焦于手性化合物的生物法合成，筛选获得了不同的有效突变体，大大推动了生物转化技术的应用。
酶催化拆分的另一种反应类型为氧化还原反应。与传统化学氧化法相比，氧化反应手性拆分具有更高的对映体选择性，通常在外消旋环酮的某个对映体的碳环里插入氧分子形成内酯，而另一个对映体不发生氧化反应。例如，Fraile等[17]选择性氧化仲醇而得到甲基酮和手性仲醇。与氧化拆分相对应，脱氢酶可以催化醛或酮不对称还原。
2.1.2在天然产物改性中的应用
天然产物在生命活动中起着非常重要的作用，大多数天然产物具有不同程度的修饰，在食品、医药领
域起着越来越重要的作用。然而，由于各种修饰作用种类和数目的差异，影响了天然产物的活性和生物利用度，成为其应用的瓶颈。因此，对天然产物进行改性是当前的研究热点。在黄酮类化合物的改性中，Sakurama等[18]从Lactobacillus brevis分离并克隆得到一种β-葡萄糖醛酸苷酶，能够高效水解黄芩苷中的糖苷键，生成高附加值的黄芩素。高斯扩散模型
Choi等[19]利用一株乳酸菌产的糖苷酶水解糖苷型异黄酮得到了异黄酮苷元。谢明杰等[20]利用Ab-sidia sp.R菌株液体发酵得到了一种大豆异黄酮糖苷水解酶，该酶能够水解糖苷型大豆异黄酮得到大豆异黄酮苷元。在人参皂甙类天然产物的改性中，Yosioka等[21]用柚皮苷酶水解人参皂苷Rb1得到了包括人参皂苷Rd、F2、CK在内的一系列活性更高的次生苷。
生物催化剂在各个领域的应用使其重要性与日俱增，有效地缓解了化学催化的困境。但是其局限也逐渐暴露出来，限制了其大规模的应用。
2.2酶催化过程中存在的问题
酶以绿、环保、温和以及特异性催化著称，但在催化反应的过程中也存在一些局限，如表1所示。在工业发酵的过程中，高温酶催化有利于传质及降低染菌的风险，但由于许多酶的热稳定性差，限制了其进一步应用。目前，已有许多提高酶的热稳定性的方法，如Li等[22]通过深入的结构分析和序列比对，结合分子动力学模拟，理性设计β-葡萄糖醛酸苷酶，使其热稳定性有了很大的提高。同时，该课
题组通过loop移植策略，获得了β-葡萄糖醛酸苷酶的3个突变体M1、M3、M8，使得其热稳定性分别提高了11.8倍、3.3倍、9.4倍[23]。关于生物催化剂的稳定性改造，冯旭东等[24]已有作详细综述，本文不再赘述。并且，部分利用价值极高的酶却由于其较低的底物特异性和选择性，致使产物不单一，副产物较多，分离纯化工艺复杂且耗费大量人力物力，使得酶的工业化应用步履维艰。因此，改造酶的底物特异性至关重要。不同的研究者采用各种理性和非理性的方法，对酶的结构和功能进行改造，使其能够定向转变为底物特异性改变或者提高的良好突变体。
表1酶催化过程中存在的问题
问题
湖北警官学院南院酶的不足
工艺限制
应用限制
后果
稳定性差，底物特异性差
DASIC高温发酵受限，产物不单一
染菌风险大，产物分离纯化困难
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第1期姜恬等：底物特异性的生物催化与酶设计改造
3酶的底物特异性改造与生物催化强化
由于酶在工业化应用中的局限性，使得科学家们不断挖掘新酶，或者通过各种化学和生物学的方法对现有的酶进行修饰改造，改变其催化特性和底物特异性，以期获得理想的催化活性。提高酶底物特异性的方法主要有化学修饰改造和针对酶分子结构的非理性和理性设计，其中理性设计作为最主要的方法，被广泛应用于酶工程研究领域。
3.1酶的化学修饰
化学修饰法是一种体外修饰的方法，通过在酶分子表面或者内部引入修饰物，利用基团之间的化学反应，引入新的结构单元，使得酶分子的功能基团或者结构发生变化，进而改变酶的活性和底物特异性。根据构效关系进行分类，酶的化学修饰可分为以下三类。其一，通过与辅酶的耦合改变酶的催化
特性。Kaiser等[25]通过将黄素与木瓜蛋白酶共价结合，从而改变了该酶的催化特性，使其能够催化氧化还原反应。其二，改变活性口袋的疏水性。Desantis等[26]通过将化学修饰与定点突变技术相结合，对枯草芽孢杆菌蛋白酶的活性口袋进行修饰，改变了其底物特异性。该作者在酶分子中引入半胱氨酸残基，利用其巯基与甲基磺酰硫醇进行硫代烷基化反应，使得酶被修饰，获得了不同修饰类型的蛋白酶。当以suc-AAPF-pNA为底物时，随疏水基团R的增大，N62C-R和L217C-R的k cat/K M值也会增大，而且绝大部分突变体的k cat/K M值都大于天然枯草芽孢杆菌蛋白酶，有些甚至增加了2.2倍，并且S166C-S-k能催化suc-PE-pNA，这是野生酶所不具有的催化活性。其三，改变活性口袋的选择性。Tonomura等[27]通过对猪胰蛋白酶进行修饰，在赖氨酸残基上引入三硝基苯磺酸，所得突变体对含有α-1,4-D糖苷键的天然底物的活性降低了50%，而其催化对硝基苯麦芽糖苷的活力增加了250%，使得该酶的底物特异性发生了转变。化学修饰的方法可以定向改进酶的底物特异性，但是在实际操作过程中，由于化学反应的参与，对酶的空间构象会有一定的影响，酶活可能会有一定程度的损失，不利于酶的进一步利用。
3.2酶的非理性设计
非理性设计是通过易错PCR和DNA Shuffling 等技术对酶基因进行随机突变和片段重组，然后通过各种高通量方法进行筛选，经过多轮突变和筛选，获得理想突变体。有研究者通过易错PCR的方法，对酶分子进行改造并筛选获得良好的突变体。例如Ellington等[28]利用易错PCR构建生物素蛋白连接酶
突变体库，结合高通量筛选方法，获得了一株底物特异性改变的突变体M157T，能够以脱硫生物素为底物进行反应，与野生酶相比k cat值提高了2～3倍；同时，该突变体对天然底物生物素的活性大大降低。李春课题组[29]从米曲霉中筛选到的β-D-葡萄糖醛酸苷酶，通过易错PCR构建突变体库，获得底物特异性增加的突变体，能够单一性获得单葡糖醛酸基甘草次酸。Toney等[30]利用定向进化技术筛选二烷基甘氨酸脱羧酶突变体，改变该酶的底物特异性，使其从天然底物AIB转向AC6C。经过多轮定向进化，最终获得5个突变体，以
AC6C为底物时k cat/K M增加了5倍左右，同时作者根据定向进化的结果，结合分子动力学模拟，确定S306F对于底物特异性的调控有重要作用。DNA Shuffling作为一种有效的DNA片段重组技术，也被广泛应用于酶分子改造。例如，Ollis等[31]利用定点突变对甲基对硫磷水解酶的活性口袋氨基酸进行定点突变，然后通过DNA Shuffling进行重排，最后筛选获得了14个底物特异性改变的突变体，其中R2F3突变体k cat/K M对该酶的非天然底物乙对氧磷的活性提高了将近100倍。也有研究者通过易错PCR 与DNA Shuffling的有效结合，筛选到了优良突变体。例如，吕凤霞等[32]通过两轮易错PCR和一轮DNA Shuffling，最终获得了地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性提高的突变体，使得酶与底物的亲和力提高，底物特异性更强，其中S10突变体酶活提高了106%。Xu等[33]通过易错PCR、DNA shuffling及定点突变技术，改造7β-羟化脱氢酶，使其催化生成熊去氧胆酸的能力增加了5.5倍。
研究者通过不同的非理性设计方法构建庞大的突变体库，结合不同的方法进行筛选，最终获得理想的
突变体。然而，庞大的突变体库使得传统的筛选方法耗时耗力，且效果较差，目前最为高效的方法是建立高通量筛选系统，快速直观地进行突变体的筛选。半理性设计和理性设计的出现，使得酶分子突变体库大大缩小，高效快速的获得理性突变体，大大加快了酶分子进化的进程。
3.3酶的理性设计
酶的理性设计通常依赖于生物信息学的方法，根据蛋白质的结构信息以及同源蛋白质的序列比较，理性选择氨基酸残基作为靶点，结合定点突变
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化工进展2019年第38卷
技术，对关键氨基酸进行突变，筛选获得目标突变体。理性设计方法的出现，有效地改善了非理性设计的诸多局限，减少了突变体库的数量，可高效快速地获得目标突变体。尤其是在酶的底物特异性改造方面，理性设计更能体现其优越性。3.3.1重塑活性口袋提高酶的底物特异性
酶的活性口袋即酶发挥催化功能的结构域，通
常由一个疏水核心构成，活性口袋中的氨基酸可分为催化氨基酸和底物通道氨基酸。底物分子进入活性口袋并与底物通道氨基酸发生相互作用，使得底物分子处于有利于催化的构象，在催化氨基酸的作用下完成催化反应。改变酶分子的底物特异性即可通过重塑酶的活性口袋使其与底物分子之间形成不同的构象或者接纳其他的底物，扩大酶的底物范围。根据重塑活性口袋的方式不同，可将其分为两类，即改变活性口袋的大小扩大酶的底物谱和改变活性口袋的微环境扩大底物谱。
（1）改变活性口袋的大小扩大酶的底物谱。活性口袋的大小直接影响了底物分子的进入和稳定，过大的活性口袋会影响底物分子的稳定性，过小的活性口袋则会阻碍底物分子的进入，不利于酶接纳更多的底物进行催化反应。因此，研究者通过调控活性口袋的大小对酶分子的底物特异性进行改造。对于较小的活性口袋，研究者通过定点突变扩大活性口袋，使其能够容纳更大的底物分子，增加了酶分子的底物特异性。Wang 等[34]通过对SMG1脂酶进行单点突变，N277F 展示了与野生酶不同的底物选择性，对于中长链脂肪酸具有更好的催化特性，通过结构分析表明N277F 使得底物通道发生变化，使其更有利于中长链脂肪酸的进入。Xu 等[35]
在研究LfAmDHs 的过程中通过计算机分析发现位于底物结合口袋远端的两个氨基酸A113和T134阻碍了底物结合口袋的打开，使得LfAmDH 只能结合较小的底物，通过定点突变得到的突变体A113G 和T134G 的活性口袋比野生型LfAmDHs 大43Å（1Å＝0.1nm ），3个突变体M1（A113G ）、M2（A113G/T134A ）、M3（A113G/T134G ）与野生型相比对六碳和七碳化合物具有更高的催化效率。
该作者成功地通过扩大酶的底物结合口袋扩大了酶的底物谱，使其能够容纳更大的底物，具有更广泛的底物谱，如图2所示。该作者推测A113和T134对于改造AmDHs 使其催化长链化合物具有重要影响，选取与LfAmDHs 氨基酸同源性分别为70.1%和95.6%的EsAmDH 和BspAmDH ，经过同源序列比对确定相应hotspots 进行定点突变，同样得到了可催化长链底物的突变体。Nie 等[36]在解析乙醇脱氢酶CpRCR 的基础上分析活性口袋发现F285、W286和W116构成了酶的底物结合口袋，并且阻碍较大底物的进入，通过突变扩大酶的底物结合口袋，获得的突变体W116A 、F285A 、W286A 和F285A /W286A 对于长链底物o -Cl-C 6H 4的k cat 值分别增加2.6倍、1.6倍、4.2倍和4.4倍。也有研究者通过缩
小酶的活性口袋，使得酶分子对小分子底物的特异性提高。Liu 等[37]通过MDS 计算RMSF 值，预测影响脂肪酶CALB 的3个关键区域，并对该区域的氨基酸在分子动力学模拟水平上进行丙氨酸扫描，确定关键氨基酸D223和A281，并对其进行定点饱和突变获得D223V/A281S ，使得最终产物丁二甲基硅氧基戊二酸甲酯的选择性从8%提高至99%以上，产量达到107.54g/(L ·d)
。该作者通过分子动力学
图2定点突变扩大LfAmDHs 活性口袋增加底物特异性［35］
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