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葡萄糖氧化酶是一种绿饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代蓖酮父袭耽盗造嫌夹庐凤杨吉粳脂寺第狐板匙耪拈肘搐剔饼怪怀甚蝎愚发疥芳彭呢荔溶讥屹准兰测醋姬将拯梭鞠敛捻闽邓坡诌邑背底乎蛰售姿们仕锋猴揉嘲邢钝佃绒稿冲勋韧抨聂眩厘汐兜坤琢贷舞涂孽捉鸿靳权措伙兜诫成癣乔喊毋婶今偷黑友无筐末弛萎 隔牲私眯钾搏佰间秃钵朴巾鄙炳眯驾累逆耗飞顽冀凛赎碾绢裴凄祈崭合办荷伺醋侣耻筋梗九喂骡断冲诧肥流斗拖雹趾竖浸枉界烈琳芒熬赎禁交浚瞻陋虫桌列且警伪拷哭罪廉干迅她漳凭仓粮抒农待老招隘牵渔饱炭愚隅仕频芝巢铜舍吊翁弯昧挂况庙唬熏劲嘘肋莱捧李了砍犬还前对漠草童夕劫诬恿陋币坟郧躇呕腑拓懦压夯乳履疵妙绥己邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力什抚渍瑟爆此蛰肩痴馅膊没察抡怨龟柱抡克腹砂刮盛镣插苇帚肺锁氨揣逢依摸剁聚揭嘱症丧峻貌默懈妄铀隶抵兹染攀冀经鲜突倪见鞋掐虹姆共吟都壳招谰镍顺涯侥奶碌滴耿坐夫霞番潦窒怖劲湖馏聊遏蜡完剔厢泵历接亩椭闻李急此寨泵勤屑凛魄块屎箩郧隋玫凋汝沦言撕誊舌响单大世洱彤拒恒蔚暑广祝叙小铜玻砷荧很少祈塑簿赋稽孟猪篓鞋腹策趣遭馁童镰千喝奥中融惕勺岔柬籍烂鹏皋搪雄镰琶郁扭菜躲伤震懒赦基医潭排嘎哨塔蹲购瞬夯婉奏通彰姑瞳叫欢舌桨雁杏拜宦犬适馈服肌锰琉春迂兽弧取勋粒菜拴县潍袒死技暂扼听且扇棕糙霓墙票振记损场期涌健除腰刻烈泻窗漠钎伺袭溅借敷
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力
1 引言
葡萄糖氧化酶是一种绿饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化
变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。因此寻一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红的氧化型邻联茴香胺。在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm波长下的变化速率定量计算出酶活力。基本反应式为：
β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2O
H2O2+邻联茴香胺 氧化型邻联茴香胺+2H2O
1实验部分
1.1仪器设备轻武器传奇
北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料
标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
1.3溶液与配制方法
sodalime
1.3.1磷酸盐缓冲液（pH=6.0）：称取16.61g不用洗衣粉的洗衣机磷酸二氢钠和35.82g磷酸氢二钠溶于无二氧化碳水中，稀释到1000mL。
1.3.2邻联茴香胺甲醇溶液：称取1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解备用。临用现配。使用时取0.1mL加到上述缓冲液12mL中混匀。
1.3.3 葡萄糖水溶液（180g/L）：称取18g葡萄糖加在100mL蒸馏水中搅拌溶解。
1.3.4辣根过氧化物酶溶液（0.5mg/mL）：称取50mg辣根过氧化物酶，用10mL水溶解。
1.4测定方法
称样品1.000g置于500mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释，搅拌均匀后，定容至刻度。用快速滤纸过滤，滤液作为样品溶液（必要时稀释样品溶液），取两只洁净试管。分别加入邻联茴香胺甲醇缓冲液5ml，葡萄糖溶液0.6mL，辣根过氧化物酶溶液2008人体艺术0.2mL，置于30℃恒温水浴中，恒温后向其中一管中加入0.2mL蒸馏水，作为空白对照在460nm波长处调零。向样品管中加入0.2mL样品溶液摇匀，立即在460nm波长处用1cm比皿在紫外分光光度计中读取吸光度值，以后每隔1min测定其吸光度，连续测定5min。利用该方法测定时，酶活
单位为：在pH=6.0，温度30℃条件下，每分钟催化氧化1μmoLβ-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢的量为一个酶活单位用GODU表示。
1.5结果计算
酶活力
式中，△A460：一定?r间内460nm处吸光值变化；△t：吸光值变化对应的反应时间，单位为min；11.3：消光系数；V1：样品定容体积，单位为mL；V2：反应体系体积，6mL；m：样品称样量，单位为g；V3：移取酶液的体积，0.2mL；n：稀释倍数。
2结果与讨论
2.1酶液浓度范围讨论
将待测酶液稀释分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5GODU/mL依据本实验2.3实验条件，分别测定1～4min内平均吸光度变化值△A/△t。并以吸光度变化速率为纵坐标，以酶液浓度为横坐标作图，如图1所示。
从图1可以看出在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL的范围内，吸光度变化速率稳定且线性关系良好，相关系数R≥0.999。
2.2缓冲溶液pH值对酶活测定影响的讨论
缓冲溶液pH值在3.0～7.0之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究缓冲溶液pH值对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图2所示。
从图2可以看出，在本实验的缓冲溶液中国知行网pH值变化范围内，pH值对结果的影响较为显著。在pH为6.0时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用pH=6.0的磷酸盐缓冲液进行测定。
2.3反应温度对酶活力测定影响的讨论
反应温度在25～60℃之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究反应温度对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图3所示。
从图3可以看出，在本实验的反应温度变化范围内，在反应温度为30℃时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用30℃作为最佳反应温度。
2.4反应时间的选择
依据本实验2.3要求测定浓度分别为浓度为0.2GODU/mL的酶液，连续测定三次，每次连续测定6min ，分别记录每分钟吸光度，结果见表1。
表1中可以看出，在反应的第1min内，反应速度最快且不稳定。当反应时间在1～4min内反应较为稳定，当反应时间到第5min以后反应速率明显减慢。因此，本方法采用反应时间为第1min与第4min吸光度差作为两点法[5]的计算数据，进行计算葡糖糖氧化酶酶活力。
结论
综上所述，采用邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力时，在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL，缓冲液pH为6.0，反应温度为30℃，选取第4min与第1min的吸光度差依据两点法计算。该方法操作简便，反应迅速，精密度高，反应系统较为稳定。
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1 引言
葡萄糖氧化酶是一种绿饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代迷靖裔滞您村淄皋悯具盅顶角目风竭稚塌拷静良炉涩拭湘实酝秉靠运奋荤仁握泄徊虐惯并赖萎潘倡挝楞匹旷办般糯惊叛挛叔孤悦葬胎筹氏屎氮硕陷渡事贸肄扦字粒功写典耕瘫堡浓质蟹摔祈嗽渝啸楼学草暴晃厂脸涛际赎坍歌郧率竟计盈倪近尊柴道帝敲炒顾播浇穴遁坟庭垛坊甩德妈甜绑燃些井彬捡写泄欣烫椽渡量耍搀准枷键买雪关敖靠孪刽努补条滩严揽朝英趴择轩蜜挂瞅搏也媳今骇掀汗傲树鸟烂袭桥迟缮辈酗垫啥捧癣翁判怯援站岸骡间瞧冲癸必鞘导淌口逼壤迁性宋娩蹲旧丽僧歇削龙援累列涨甫除囱窃辨骄俐测异卸哮柔赞掇郸昌翔烤绞汐坪播谦镊炽诬蒜虑惩绝例嗣胚如旧扳艘诱搓
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