教育差、生活条件差的地区幽门螺杆菌的感染率明显高，而幽门螺杆菌流行率高的国家胃癌发病率也明显高，控制幽门螺杆菌的感染率可以明显降低胃癌的发病率[23,24]。当然，也有研究发现幽门螺杆菌的感染率与食管炎和胃贲门腺癌的发生呈负相关，但对此至今仍存在争议。有证据表明过咸的食物、N-亚硝基化合物摄入过多，新鲜的蔬菜和水果摄入过少会增加胃癌的发生率。幽门螺杆菌会促进产亚硝酸盐的细菌生长，抑制抗坏血酸的产生，一种亚硝酸盐和氧自由基的清除剂[25,26]。前瞻性研究发现吸烟和胃癌的发生呈剂量依赖关系，吸烟尤其会促进远端胃癌的发生[27]。另外，肥胖是胃贲门腺癌的一个主要的危险因子，这可能是由于肥胖引起的胃食管返流，最终引起Barrett’s食管而发展为胃癌[28,29]。其它不常见的危险因子还包括：胃癌家族史、恶性贫血、A型血、胃手术史等等。 基于以上流行病学概况不难发现，胃癌的发生不仅存在种族间的差异、具有家族遗传倾向，而且存在地理分布的差异，受饮食和生活环境的影响，因此，从分子层面讲，胃癌的发生受到遗传学和表观遗传学的影响，并且随着基因微阵列技术的发展，表观遗传学和基因微阵列技术的结合应用使得对胃癌患者及胃癌复发患者的全基因组表观遗传学的筛选成为可能，从而为研究胃癌发生及复发的分子网络调控机制提供有力的支撑，并有可能寻到新的生物标志物作为胃癌的筛选标志，寻胃癌的靶向位点。 表观遗传学已经发展成为科学研究最有影响力的区域之一，并广泛的调节着人体重要的生命过程例如：老化、发育、记忆的形成，表观遗传学被广泛的定义为在没有DNA序列的变化之下，DNA和染质发生的任何可以遗传的变化[30-32]。引起表观遗传学失调的发生机制也不断被发现，如今，表观遗传学的研
究也开始由对特定基因进行甲基化或组蛋白修饰的研究向对全基因组的表观遗传学修饰研究，以期发现表观遗传学的变化是在什么时候发生以及为什么会发生这种变化。引起基因表观遗传学修饰的机制不同，它们通过影响DNA的稳定、折叠、定位或组织而发生作用，其中研究最多的机制包括DNA甲基化修饰、组蛋白重塑、组蛋白修饰、非编码RNA调控。DNA甲基化的模式在发育过程就以形成，一旦形成在整个生命进程中非常稳定，另一方面，组蛋白修饰是可以逆转的，以此促进或者抑制基因的转录。肿瘤的发生可以导致甲基化修饰的改变或染质重塑过程的失调，从而导致基因表达的显著差异[33]。为了更好的理解表观遗传学的基因表 达调控机制，几项技术已经被发展起来用于检测DNA的甲基化修饰和染质修饰，检DNA甲基化修饰最常用的方法是亚硫酸盐修饰，检测染质修饰最常用的方法是染质免疫共沉淀。
胞嘧啶5-炭原子的甲基化修饰是影响基因活性的可逆化过程，DNA甲基化在基因表达调节中起到重要的作用，并广泛影响整个生命过程。基因的半甲基化模式在胚胎时期就已形成，改变其已有的模式会产生广泛的影响，异常的甲基化状态在肿瘤的发生以及遗传性疾病中发挥重要作用。DNA甲基化是由DNMT（DNMT methyltransferase）催化SAM（S-adenosyl-L-methionine）中的甲基基团转移到CpG中的胞嘧啶形成的[34]。DNMT包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1在维持胚胎时期就已形成的DNA半甲基化状态中发挥重要作用，而DNMT3a和DNMT3b 在DNA的从头甲基化作用中发挥重要作用。DNA的甲基化位点主要发生于CPG岛，CpG岛是一段进化上高度保守的DNA序列，富含包嘧啶和
鸟嘌呤。一般来说，DNA 的高甲基化往往导致基因的低表达，少数情况下也会导致基因的高表达[35,36]。对肿瘤形成前，形成过程中及形成后进行特异CPG岛甲基化表达谱的研究，有可能为临床医师通过鉴定患者的甲基化状态提供准确的诊断信息，也可能发现新的被甲基化调节的抑癌基因。DNA的甲基化会阻碍转录因子的转录从而降低基因的表达，MBDs（methylcytosine binding domain proteins）结合到甲基化位点也会阻碍基因的转录，MBDs是基因甲基化作用与组蛋白修饰作用协调抑制基因表达的连接点，MBDs可以结合组蛋白修饰酶，偶联基因甲基化作用抑制基因的表达。
组蛋白修饰也对基因的表达产生深远的影响，包括乙酰化、甲基化、磷酸化[37]。HDACs（histone deacetylases）和HATs（histone acetyltransferases）二者之间的平衡决定组蛋白乙酰化的水平，一般来说组蛋白乙酰化会增加基因的活性，而组蛋白去乙酰化会抑制基因的转录水平，原因在于去乙酰化可使染体凝集而乙酰化可使基因暴露于影响基因表达的细胞因子。研究发现导致基因沉默的原因往往是基因甲基化和组蛋白修饰共同作用的结果，二者通过MeCPs（methyl CpG binding proteins）相互作用，MeCPs既可以结合DNMT也可以结合HDACs 和HMTs，在基因甲基化和组蛋白修饰之间发挥桥梁的作用，但是基因甲基化导致了组蛋白的修饰还是组蛋白的修饰影响了基因甲基化至今还不清楚[38,39]。
随着基因芯片技术的发展使对全基因组的基因甲基化筛选成为可能，并且生
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物信息学在基因芯片中的应用也发挥了巨大的潜力，例如，一个基因存在四个变体，若我们只想得到某一个变体的基因表达量，我们就需要对四个变体的序列进行Blast分析，到其与其它变体不一样的特异序列进行引物设计，若果想得到四个变体的基因表达量，就需要出所有变体共有的序列进行引物设计。但基因芯片也存在样本量低、探针对所要筛选的基因特异性差等问题，所以对基因芯片筛选结果也要进行qRT—PCR（real-time quantitative PCR）验证。
自从实时荧光定量PCR被首次报道以来[40]，在很多方面被广泛的应用，包括mRNA表达量的研究，基因组和病毒基因拷贝数的研究[41,42]，等位基因鉴定试验[43,44]，基因特异剪接体的表达分析[45,46]，石蜡包埋组织中[47]和激光捕获显微细胞[48]基因的表达量。实时荧光定量PCR有两个比较重要的概念：荧光阈值（Threshold）和Ct（threshold cycle），荧光阈值是指刚能被检测到的荧光信号强度，是人为设定的，一般设定为3-15个循环10倍标准差。Ct是指从初始模板量经扩增达到能被检测到的荧光阈值所经过的循环数，初始模板量越大则Ct值越小，反之则Ct值越大[49]。目前常用的qRT—PCR方法有TaqMan探针法和荧光染料法，TaqMan探针法的原理是在引物探针的5′偶联报告基团，3′偶联淬灭基团，因为一般情况下二者相距较近，5′报告基团发出的荧光会被3′淬灭基团中和，但当解链时，DNA聚合酶发挥5′→3′外切酶活性，使报告基团和淬灭基团彼此分开而发出荧光。常用的报告基团有FAM（6-carboxyfluorescein）、TET(tetrachloro-6-carboxy-fluorescein),HEX(hexacholoro-6-carboxyfluor escein）、VIC，常用的淬灭基团有TAMRA（6-carboxytetramethylrhod-amine）和DAB
CYL（4-(dimethylaminoazo)benzene-4-carboxy-lic acid）。荧光染料的原理是SYBR Green 1会结合到双链DNA的小沟内，当DNA解链时SYBR Green 1会解离，解离状态的SYBR Green 1只发出微弱的荧光，当结合到双链DNA的小沟内时就会发出强烈的荧光[50]，该方法的缺点是特异性较差，容易受到引物二聚体和非特异性扩增的影响。对扩增产物量的定量包括绝对定量和相对定量，绝对定量要求准确计算出初始模板量，而相对定量只需测定实验组与对照组相对表达差异。为了纠正加入的初始样本量基线情况不一致，需要内参基因进行纠正，内参基因一般为在个体的各细胞组织中稳定表达的管家基因，不受外界环境的影响，常用的内参基因包括：β-actin,GAPDH（glceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase），cytoskeletal protein，rRNA（ribosomal RNA）。
实时定量的验证只是局限于转录水平，表达水平的验证还需要借助于蛋白质测定技术。为了探讨所筛选的基因在胃癌发生中的作用，也需要进行分子克隆实验，纯化表达出的蛋白质进行基础研究，并在细胞系内验证该基因引起胃癌发生与复发的信号通路，从而寻出特异的可能用于的靶点。筛选出的基因未来能否成为胃癌复发筛查的生物标志物，也需要在其它腺癌中进行初步的排查，看该基因的高表达对于胃癌是否具有高特异性，我们初步选取的腺癌为肝癌细胞进行验证。
材料和方法
1临床材料：胃癌组织是从福建省肿瘤医院组织库获得，三年内未复发（L- DFS ）
病例两例，一年内复发（ S-DFS ）病例三例，六例标本临床诊断均为胃腺癌
Ⅲ期病人，以上所有标本均未经过放化疗。
2 试剂和器材
2.1 主要试剂
Zymo EZ DNA Methylation kit（包括ncludes bisulfate-conversion reagent, dilution
buffer,desulphonation buffer, elution buffer），样品基因组DNA( gDNA，≥500 ng)，NaOH, MA1,
RPM, MSM，FMS, PM1, 100% 异丙醇, RA1, PB2, 100% 乙醇, XC4，PB1, RA1, XC1, XC2,
TEM, XC3, STM, ATM, 95%甲酰胺/1 mM EDTA，(Alconox Powder Detergent, 乙醇),
MagCore Total RNA Cultured Cells Kit (台湾芮宝生医股份公司)，UniRed核酸染料（北京有
尼康生物科技有限公司），QIA amp DNA Mini Kit （QIAGEN，51306 ），反转录试剂盒Trans
二次革命论
Script First -Strand cDNA Synthes is Super Mix（AT 3 0 1 ）（北京全式生物技术有限公司），
舞弊三角理论
2.2 主要器材
玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，Thermocycler, 96 孔skirted microplate(0.2
ml)，杂交炉，新MIDI plate，振荡器，室温离心机，heat block，4°离心机，tube rack，heat
sealer，foil heat seal，金属箔，芯片，Hyb Chambers 杂交盒，Hyb Chamber gaskets 杂交盒衬
垫，Hyb Chamber inserts，Multi-Sample BeadChip Alignment Fixture，Te-Flow，Flow-Through
医患法律关系Chambers (with black frames, spacers, glass back plates, and clamps)，Wash Dish，Wash Rack，
staining rack，tube rack，真空泵，Kimwipes，iScan，MagCore Compact核酸抽提仪（台湾芮
宝生医股份公司），HE-120多功能水平电泳槽（上海天能科技有限公司），
2.3 试剂配制
(1)中性甲醛固定液：
甲醛 100mL
磷酸氢二钠 6.5
山西省测绘局磷酸二氢钾（钠） 4g
双蒸水 900mL (2)苏木精、伊红染液为碧云天产品
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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