先天性心脏病圆锥动脉干畸形NKX2-5基因CpG岛甲基化状态分析 盛伟1王慧君2马晓静3李文灿4陈龙4张进1黄国英3马端1,2,3*
(1.复旦大学上海医学院分子医学教育部重点实验室，上海200032; 2.复旦大学生物
医学研究院，复旦大学出生缺陷研究中心，上海200032; 3.复旦大学附属儿科医院，复旦大学儿童发育与疾病转化医学研究中心，上海200032; 4.复旦大学法医系，上海200032) =摘要>目的研究心肌特异性转录因子N K X2-5基因启动子区在先天性心脏病圆锥动脉干畸形(CT D)病例中的甲基化状态，从表观遗传学角度探讨先心病的发病机制，为先心病的早期临床诊治提供 理论依据。方法首先利用T r u1l限制性内切酶将基因组片段化并接上接头，然后利用甲基化结合蛋
白(M BD)与甲基化DN A特异性结合的特点对甲基化DN A片段进行富集；针对N KX2-5基因启动子区
的CpG岛设计引物，通过实时定量PCR检测CT D与正常胎心组织中N KX2-5基因甲基化状态。结 果通过与正常心脏组织相比,N K X2-5基因在6例病变组织中均发生了不同程度的甲基化，其中4例
呈现高甲基化，另外2例甲基化程度无明显变化。结论N KX2-5基因甲基化可能与先心病CT D发病
相关，可能成为先心病早期诊断的分子标志物之一。
=关键词>先天性心脏病；圆锥动脉干畸形;N KX2-5基因；甲基化；分子标志物
The C pG Island Methylation Status Analysis in the Promoter Region of the C onotruncal Heart Malformation
C andidate Gene NKX2-5
Sheng Wei1Wang H ui-j un2Ma X iao-j ing3L i Wen-can4Chen L ong4Zhang Jin1H uang Guo-ying2Ma Duan1,2,3
麦兜族
(1.K ey L aboratory of Molecular Medicine,Ministry of Education,S hang hai Medical College,Fudan University,shanghai200032,China; 2.Research Center f or Birth Def ects,F udan University, Shanghai201102,China; 3.Research Center f or Child ren Dev elopment and T ranslational Medicine, Children H osp ital,Fudan University,Shang hai200032,China)
=Abstract>Objective To study the promoter methylation st atus of heart t issue-specific transcript ion factor NKX2-5gene between congenit al heart conotruncal defects(CTD)and norm al fet al cardiac t issue samples,and to investigate the pathogenesis of congenital heart disease from the epigenetic p
oint of view. Methods First,t he genome DNA fragment s were generated by the T ru1l restriction enzyme and t hen connected to t he adaptor.The methylated DNA fragments w ere enriched by the m et hylated binding protein(MBD),which can specifically bind and interact w ith methy-l CpG island.Finally,t he CpG island methylation st at us in the promoter region of NKX2-5gene was detected by Real Time PCR.Results In6
CT D cases w e detected,4showed hypermethylation status in NKX2-5gene promoter,compared w ith normal fetal heart t issue.Conclusion NKX2-5gene hypermethylation might be one of molecular m arker of congenital heart disease.
=Key words>Congenital heart disease;Conotruncal defects;NKX2-5gene;Methylation;Molecular marker
spwm*通讯作者：马端,Em ail:duanma@shmu.edu聚合硫酸铝
先天性心脏病(cong enital heart disease)，简称先心病，是指胚胎发育过程中心脏结构发生异常的一类疾病。近年来出生缺陷调查资料显示，先心病已跃居我国出生缺陷畸形首位，发病率占活产新生儿的6j~10j[1]。圆锥动脉干畸形(congenital heart conotruncal defects,CTD)是先心病中最为严重的一种类型，约占先心病的30%[2]。CT D是指在遗传和环境因素的共同作用下，胚胎发育早期心脏流出道和
大动脉发育异常，临床上表现为法洛四联症、肺动脉闭锁、大动脉转位、右室双出口、永存动脉干等多种复杂心血管畸形，常出现紫绀和低氧血症，是造成我国婴儿和新生儿死亡最主要的原因之一。
心脏特异性转录因子NKX2-5高度保守，是脊椎动物心脏育生中较早表达的转录因子，是心脏前体细胞最早的标志物，参与心脏发育的整个过程。NKX2-5自胚胎发育第7.5天开始持续表达，其正常表达对心脏的环化、心房及心室发育、动脉干分隔、房室瓣形成及房室传导的维持均起重要作用[3]。动物实验显示,NKX2-5参与了胚胎心脏发育，是引起心脏畸形的关键因素，敲除NKX2-5基因的小鼠胚胎在10.5天由于心脏缺失而死亡[4]。临床研究显示,NKX2-5基因在患儿人中发生突变的比例非常低，如法洛四联症和房间隔缺损患者中仅有4%发生突变[5]。最近也有学者提出，基因序列的改变不是NKX2-5引起心脏畸形的主要原因[6]。
除了编码序列改变可以导致基因的功能异常以外，基因启动子区域的甲基化变化也可以影响基因的表达，从而使所编码的蛋白出现量的差异。本研究拟通过比较该基因在正常心脏组织与CTD病变组织中的甲基化状态的差异，了解N KX2-5基因的甲基化状态与CTD的关系，为先心病的早期基因诊断提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
人民日报十论
1.1.1主要试剂Tru1l限制性内切酶购自Fermentas公司,IPTG购自Prom eg a公司，蛋白酶抑制剂购自Sigm a公司,Glutathione Sepharose4B 购自GE H ealt hcare公司，组织基因组DN A提取试剂盒购自AXYGEN公司,PCR产物回收试剂盒购自QIAGRN公司,LA T aq聚合酶、T4DN A连接酶和实时定量PCR试剂均购自T aKaRa公司，所有引物均在上海桑尼生物公司合成。含有PET4-GST-MBD重组质粒的大肠杆菌为本实验室保存。
1.1.2研究材料正常儿童心脏组织取自复旦大学法医学系。圆锥动脉干畸形病变组织由复旦大学附属儿科医院提供。本研究涉及的人体组织样本均经所有研究对象签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1N KX2-5基因启动子区CpG岛预测及Real T im e PCR引物设计登陆g enom e.ucsc. edu/网站，查人的N KX2-5基因启动子区，通过甲基化分析软件(M ethy l Primer Ex press v1.0)确定启动子区的CpG岛位置，根据Tr u1l限制性内切酶的酶切位点，确定Real T ime PCR的扩增区域，然后利用引物设计软件(primer premier5)设计Real T ime PCR引物。
1.2.2基因组片段化与接头连接组织样品基因组DNA按照QIAGEN公司的组织基因组DNA提取试剂盒步骤进行提取。取正常心脏组织和CTD 病变组织基因组各1L g，利用Tr u1l限制性内切酶进行酶切，反应体系为：各基因组1L g,T ru1l酶1L L,10@buffer2.5L L，补加灭菌蒸馏水至终体积为25L L，再加入1
0L L石蜡油防止蒸发，反应条件为65e3~4小时，利用酶切回收试剂盒对酶切产物进行回收。接头引物序列为:H-24,5-AGG CAA CT G TGC TAT CCG AGG GAT,H-12,5-T AA T CC CTC GGA。各取200L M的接头引物100L L,94e5分钟，然后将2种引物汇合，自然冷却形成接头。利用T4DNA连接酶，将基因组DNA酶切回收产物与制备的接头进行连接，反应体系为:10@T4buffer5L L，酶切回收产物10L L，接头2L L,PEG40004L L,T4连接酶2L L，补加灭菌蒸馏水至终体积为50L L，反应条件为16e，过夜。1.2.3GST/M BD融合蛋白的表达纯化及活性检测将含有PET4-GST-MBD重组质粒的大肠杆菌在LB-Kan平板上进行划板,37e培养过夜；挑取单克隆，接种于10ml LB-kan液体培养基中；次日将培养
液接种于200ml LB -kan 液体培养基中进行扩大培养；用终浓度为1mM 的IPTG 诱导3~4小时以表达GST /M BD 融合蛋白，分别在1.5小时(诱导前)、4小时(诱导后)取待检测样品，通过SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染检测诱导表达结果。200m l 诱导后菌液离心后悬浮在PBS -T (1%Triton X -100)缓冲液中，此缓冲液中含有终浓度为1mM 的PM SF 和50mg /m l 的溶菌酶，冰上放置30分钟，超声破碎细胞，溶解产物经高速离心，上清过Glutathione Sepharose 4B 层析柱，并用10倍柱体积的PBS 洗去非特异性结合的蛋白，用低盐浓度结合缓冲液洗去大肠杆菌DN A，最后获得纯化的GST /MBD 蛋白[7]
。本实验室前期研究已证实，采用不同的盐离子强度的缓冲液进行洗脱，可以把甲基化的DNA 和非甲基化的DNA 分开，实验条件为:100m M NaCl 缓冲液为结合缓冲液,500mM NaCl 缓冲液为洗涤缓冲液,
1000mM NaCl 的缓冲液为洗脱缓冲液[8]。
1.2.4基因组中甲基化DNA 富集 取GST/MBD 蛋白层析柱100L L，离心去上清，用100L L 500mM NaCl 的洗涤缓冲液平衡2次，在含有100mM NaCl 的结合缓冲液中结合基因组DNA，放在摇床上4e 结合1小时。用500m M NaCl 的缓冲液洗涤，以去除非甲基化DNA，最后用1000mM NaCl 的洗脱缓冲液洗脱并回收甲基化DNA 。
1.2.5LM -PCR 扩增富集甲基化DNA 由于富集下来的甲基化DNA 量较少，不能满足后续实验的要求，因此需要对富集的甲基化DNA 进行有效的扩增。以富集的甲基化DNA 为模板,H 24为引物进行2轮LM -PCR 扩增，从而获得足够量的富集甲基化DNA 的PCR 产物，用PCR 产物回收试剂盒进行纯化回收,-20e 储存以备后续研究。
1.2.6Real Time PCR 检测样本中NKX2-5基因的甲基化状态 采用SYBR Green Real T ime 检测样本NKX2-5基因启动子区CpG 岛的甲基化状态。实验中选取6例先天性圆锥动脉干畸形组织样本和1例正常心脏组织样本作为研究对象，各取100ng 富集甲基化DNA LM -PCR 产物为模板，以DXZ4
为内参，利用比较定量法，根据Ct 值与起始模板拷
贝数呈线性关系，分析不同样本中Ct 值的变化，每个样本重复3次，取其平均值。反应体系及反应条件严格按照试剂盒说明书进行。2 结果
2.1 NKX2-5基因启动子区CpG 岛的预测及Real T im e PCR 扩增区域的确定 利用g enom e.ucsc.edu/网站及甲基化分析软件(M ethy l Pr im er Ex press v 1.0)确定NKX2-5基因转录起始点上游5kb 内有3个CpG 岛(图1)，根据T ru1l 酶切片段的大小以及启动子区的确定，本研究选取了CpG 岛2中的1段，利用引物设计软件(prim er premier 5)设计Real Time PCR 引物，其上游引物为:GGCT TT GATGAGGGACAGGA，下游引物为CAAGGT GCGGAGGAAACG，产物长度为162bp 。
图1 NKX2-5基因启动子区CpG 岛分布
2.2 基因组DNA 片段化与接头连接分析 Tru1l 酶切位点是TTAA，对基因组DNA 进行酶切时可以保
留绝大部分CpG 点的完整性，同时片段化基因组的大小集中在300~700之间(图2A)，符合实验的预期目标。接头连接的成功与否直接关系到后续实验的成败。以连接产物为模板,H24为引物进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳分析表明接头连接成功(图2B)。2.3 GST /M BD 融合蛋白的表达纯化 含有PET 4-GST -M BD 重组质粒的大肠杆菌，用IPT G 诱导表达GST /MBD 融合蛋白,SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳
检测结果表明，在菌液的上清中有大量的融合蛋白表达，表达的融合蛋白经过Glutathione Sepharose 4B 柱纯化，可以得到纯度较高的蛋白，其分子量大小与预期大小一致(图3)。
2.4 Real T ime PCR 检测结果分析 通过Real T im e PCR 检测，与正常心脏组织相比，不同CTD 病变组织中NKX2-5基因的Ct 值发生不同程度的改变(表1)，其值变化范围在15~35之间，属于正
图2 基因组酶切片度回收和接头连接产物PCR 图M :M ark er II;1：正常心脏组织基因组;2:
病变组织基因组。
图3 GST /M BD 融合蛋白的表达和纯化M :M ark er;1、2：诱导前上清中蛋白;3：诱导后上清中蛋白;4：纯化蛋白
常分析范围；根据其扩增曲线(图4)以及RQ 柱状图分析(图5)，样本T8、T 11、T27和T76呈现高甲基化，分别是正常心脏组织样本的3.5、4.2、2.1和2.4倍,T6和T 19则无明显变化。
表1 正常心脏组织和不同病变组织样本中N K X 2-5基因
Real T ime PCR Ct 值
NKX2-5Ct 值
DXZ4Ct 值v C t v Ct SET Normal 20.19615.153 5.0420.017T619.39914.558 4.8410.019T817.96114.715 3.2450.023T1117.94014.954 2.9860.022T1919.54514.455 5.0900.029T2718.67214.712 3.9590.021T76
20.131
16.364
3.767
0.
067
图4 NKX2-5基因启动子甲基化Real T ime PCR
扩增曲线图
图5 NKX2-5基因启动子甲基化Real T ime PCR RQ 检测结果
3 讨论
人NKX2-5基因定位于染体5q35，含2个外显子，编码324个氨基酸。NKX2-5基因位于众多对心脏发育有重要作用基因的上游，如T FGBR3、
EDG7、BM P10、CX43、NPPA，以及最近发现的
Etsrp71和Chibby 等。应用原位杂交技术发现在NKX2-5基因纯合敲除小鼠中,A np 、M eCP2C 、Carp 等基因表达受到严重干扰[9]
。同时,NKX2-5基因也受Nodal 、Shh/Ihh 、Wnt 、Notch 和BM P2等多个早期胚胎发育相关的信号通路调节[10]。
NKX2-5基因启动子区存在多个具有重要功能的启动子、增强子，以及抑制因子和自动调节因子的结合元件。这些元件在与相应的转录因子结合后，在不同的时间和空间调控NKX2-5基因的表达。本研究利用甲基化结合蛋白(M BD)能够与甲基化DNA 特异性结合的特性，将酶切后片段化的基因组甲基化DNA 进行有效地富集，同时根据Real T ime PCR 中Ct 值与起始模板拷贝数呈线性关系这种理论，利用SYBR Green Real T im e PCR 检测CTD 样本和正常心脏样本中NKX2-5基因启动子区CpG 岛的甲基化状态。结果表明，该方法灵敏度高，准确性强，能够有效地检测出不同样本之间的甲基化状
态。在所测的6例CT D组织样本中，与正常组织样本相比,4例呈现高甲基化,2例甲基化状态改变不明显。由此推断,N KX2-5基因表达异常可能与该基因启动子区甲基化有关。今后我们将扩大样本检测量，以进一步证实这个重要的现象。
总之，在本研究中，通过Real Tim e PCR检测，我们发现在CTD病变组织中NKX2-5基因启动子区CpG岛发生了不同程度的甲基化，表明该基因启动子区CpG岛甲基化可能与先心病的发生有关。同时，
这种变化有可能对先心病的早期基因诊断有价值，值得进一步探索。
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编辑：郑枫芸
(收稿日期:2010-08-23)
读者#作者#编者
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