DNA甲基化是近年来研究的热点，因为越来越多的证据表明，它参与了胚胎发育、基因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举⾜轻重的作⽤。甲基化状态的改变被认为是引起癌症的⼀个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化⽔平的降低和CpG 岛局部甲基化⽔平的异常升⾼，从⽽导致基因组的不稳定（如染⾊体的不稳定、原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。
检验检疫局英文
DNA的甲基化分析，有很多条路可以选择，从亚硫酸氢盐转化这条主⼲道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、测序和焦磷酸测序等。然⽽，并⾮所有⽅法都能提供单个CpG位点的定量数据。亚硫酸氢盐处理+测序⼀度被认为是甲基化分析中的⾦标准，但如果对5-10个克隆测序，这种⽅法充其量只是半定量。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本⾝能检测并定量甲基化⽔平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺⼊量来定量确定单个位点的C-T ⽐例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。
同时，新⼀代测序（NGS）在甲基化研究中也开始崭露头⾓。454（后被罗⽒收购）以焦磷酸技术为基础，开发出了新⼀代测序平台。之后，Illumina的Solexa测序仪和ABI的SOLiD测序仪陆续推出。这些⼤规模并⾏测序平台带来了不断提⾼的通量，同时使测序成本不断下降，⽬前正⼴泛应⽤于基因组测序和重测序、转录组分析和表观基因组研究。对于甲基化研究，这些平台带来了⾮常灵敏的DNA甲基化图谱，以单分⼦分辨率覆盖整个CpG岛。
基利冈萨雷斯
新技术不断涌现，我们在实际应⽤中应如何选择，才能发挥出它们本⾝的优势。科学家们也在不断探索。德国汉诺威医学院Anna Potapova领导的研究⼩组对454测序
和QIAGEN的焦磷酸测序进⾏了系统的交叉验证。在今年1⽉的《BMC Biotechnology》上，他们发表了他们的研究成果1。
研究⼈员分析了10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式。他们先对基因组DNA开展亚硫酸氢盐修饰，再利⽤120对引物对选定的位点进⾏扩增，之后开展454测序和焦磷酸测序。他们将454测序所获得的单个CpG位点的甲基化⽔平与传统焦磷酸测序的相应值进⾏了⽐较。统计分析表明，所有单个CpG位点的甲基化⽔平都有着极佳的⼀致性。
作者认为，⾼通量的454技术实现了整个CpG岛的更全⾯覆盖，且单分⼦分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它能够平⾏研究多个位点。同时，作者也强调，这些优点也伴随着⼀些劣
势，⽐如相当⼤的⼀笔投资、试剂昂贵、周转时间长、数据分析要求⾼等。这些特点使得454测序更适⽤于在基因组范围内⽬标区域的确定，⽽对不同样品在⽬标区域的CpG位点的定量分析由于样⽅数量⼤，如果每个样品都采⽤454技术进⾏分析，则成本就会过于巨⼤。
相⽐之下，QIAGEN的焦磷酸测序更快、更简单，且便宜得多。它能够以相同的准确性和分辨率带来同样⾼分辨率的数据，⽽费⽤只有454测序运⾏的⼀⼩部分。如果是针对已确定的⽬标区域进⾏甲基化定量分析，那么传统的焦磷酸测序不啻为最佳⽅
法。与之相印证的是，⽬前QIAGEN的焦磷酸测序技术已逐步应⽤于临床诊断中，如消化道肿瘤相关的KRAS基因，BRAF基因的突变检测，肺癌相关的EGFR基因突变的检测，以及⽩⾎病相关的NRAS基因突变的检测。
这篇⽂章中的数据展⽰了454测序和QIAGEN焦磷酸测序对⼤部分CpG位点带来了明显⼀致的结果，即使是那些表现出不同甲基化模式或甲基化⽔平极低的位点。作者强调：“在我们看来，传统的焦磷酸测序和454测序并⾮竞争⽅法，⽽是互补⽅法，它们在DNA甲基化分析领域执⾏了不同的功能。”
美国亚特兰⼤疾控中⼼的研究⼈员也曾利⽤焦磷酸测序技术，来定量PRFI启动⼦的甲基化⽔平2。PRFI基因在免疫监视中发挥重要作⽤，其启动⼦区域CpG位点的差异甲基化导致了PRFI的差异表达。研究⼈员以焦磷酸测序为基础，开发出⼀种⽅法，来定量32个CpG位点的甲基化⽔平。他们认为，环境工程学报
《产业结构调整指导目录(2011年本)》
这种位点特异的定量⽅法⾮常适合免疫功能紊乱等疾病的⼤规模分⼦流⾏病学研究。
QIAGEN 的PyroMark平台⽤于特定区域CpG位点分析，除了提供每个位点的甲基化程序信息之外，还很好地解决了甲基化检测中很重要的⼀个环节——亚硫酸氢盐转化完整性质控。由于在⼈类与动物中，模板序列中后⾯不是鸟嘌呤G的胞嘧啶C不会被甲基化，因此通过亚硫酸氢盐的处理和PCR 后转化成胸腺嘧啶T。如果所有模板的这些位置都显⽰出胸腺嘧啶T，⽽不是胞嘧啶C，即可确认实现了完全的亚硫酸氢盐转化，这些结果均可在测序结果中⼀⼀体现（图1）。
图1. 多个相邻的CpG 位点的分析。在单次焦磷酸测序运⾏中定量9个独⽴的CpG 位点的甲基化（以灰
⾊突出显⽰）。分析序列背景中位点特异的信息代表了⼴泛的序列甲基化模式。注意含有胞嘧啶的内置质量控制位点（以暗黄⾊突出显⽰）转化成胸腺嘧啶，说明被处理DNA 的亚硫酸氢盐转化充分。孕妇餐厅
水中声速除了甲基化分析，QIAGEN焦磷酸测序的优势还让它成为⾼通量和单个位点分析的理想选择，包括基因分型和等位基因拷贝数定量，微⽣物鉴定和耐药性分型，以及基因组测序研究的数据验证。
QIAGEN⽬前提供了三种焦磷酸测序仪器，通量由低到⾼，适合不同的应⽤。PyroMark Q24可对最多24个样品进⾏焦磷酸测序。需要⼤样品量的应⽤更适合在PyroMark Q96 ID 上进⾏。考虑到处理成百上千个样品需要⼤量试剂，⽽运⾏通量最⼤化可能会使实验成本变得很⾼。故PyroMark Q96 MD 装有⼀台⾼度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进⾏准确测序。
除了焦磷酸测序仪，QIAGEN还提供了多种产品，覆盖甲基化研究的每个流程，包括样本的采集和稳定，基因组DNA 纯化，亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测，针对⼈类基因组的所有CpG位，QIAGEN 还提供经⽣物信息学验证的Assay，⽤户可直接使⽤⽽⽆需进⾏实验设计。详细请看《Qiagen为您奉上完整的甲基化研究⽅案》和登陆lobe查相关的Assay。
参考⽂献
1. Potapova, A., et al. (2011) Systematic cross-validation of 454 sequencing and pyrosequencing for
the exact quantification of DNA methylation patterns with single CpG resolution. BMC Biotechnol. 11: 6.
2. Narasimhan, S., et al. (2009) Determination of quantitative and site-specific DNA methylation of perforin by pyrosequencing. BMC Res Notes. Jun 12;2:104.
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