刘文玺 张媛
转录水平siRNA介导的基因沉默阿明小菜
中国特新型城镇化道路左刚毛建平*
（军事医学科学院放射和辐射医学研究所北京100850）
摘要siRNA (small interference RNA)在转录后水平有效地沉默基因表达的现象称为RNAi (RNA interference , RNA干涉), 传统认为它能在转录后水平上有效地沉默基因的表达 (post transcriptional gene silence, PTGS)。然而，最近实验研究表明，siRNA是一些甲基化转移酶活化的起始信号，在siRNA的作用下，甲基化转移酶使DNA区域包括胞嘧啶 鸟嘌呤核苷酸连续区（称为CG岛），CNG（N：A/T/C/G），CHH（H：A/C/T）中的胞嘧啶核苷C和组蛋白H3亚基第9个赖氨酸K（lysine residue K9 in histone H3, H3K9）发生甲基化，基因表达为此而受到抑制，即siRNA能在转录水平调控基因的表达 (transcriptional gene silence , TGS). 同时，siRNA在异染质的形成中也起着重要的作用，RNAi突变会激活原异染质区域中沉默基因的表达。 关键词siRNA表观遗传RdRM异染质
收稿日期：2005 08 22修回日期：2005 09 21
* 通讯作者，：(epigenetics)主要研究非基因序列改变所致基因表达水平的变化，包括DNA甲基化和组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等修饰导致的染质重塑［1］。DNA甲基化及其相应组蛋白甲基化引起的异染质的形成是表观遗传学研究的首要内容。DNA甲基化一方面在细胞发育过程中对基因表达调节起着重要作用；另一方面,它与肿瘤等疾病的发生发展也有着极为密切的关系，特别是抑癌基因CG岛的甲基化问题在近年来愈来愈受到重视。 RNAi是由双链RNA（dsRNA）诱导的在植物、动物和许多真菌中均存在的序列特异性基因沉默现象。自Fire等［2］在线虫（C.elegans）中发现该现象以来，RNAi已成为基因功能研究的主要工具之一。来源于人工导入、RNA病毒、转座子或重复序列等的dsRNA被Dicer酶加工成21~26nt长的siRNAs，这些siRNAs与一些蛋白组分形成一个沉默效应复合体RISC（RNA induced silence complex），降解与siRNA互补的mRNA序列从而沉默基因的表达。除Dicer酶家族外，RISC中的另外一类重要的功能蛋白是能与RNA有效结合的Argonaute（Ago）家族蛋白，它们具有高度保守的结构域。鉴定Ago家族是生化上鉴定发生RNAi的标志之一［3］。
传统认为，siRNA调控基因的表达发生在转录后水平（PTGS），即切割特异mRNA而沉默基因的表达。然而，目前研究发现siRNA也在转录水平通过调节DNA甲基化及其相应组蛋白的甲基化而调控基因的表达。siRNA引起的DNA和组蛋白甲基化以及异染质形成的研究进展如下：
1RNA与 DNA甲基化siRNAs或miRNAs诱导的转录后基因沉默具有高度的序列特异性，是RNA RNA序列相互识别及碱基配对的结果，可是，RNA也能与DNA形成配对，正是基于这一配对原则，使得siRNA在基因组DNA水平影响基因功能。
RNA指导的DNA甲基化（RNA directed DNA methylation, RdDM）最早发现于类病毒感染的烟草［4］。类病毒是一种二级结构高度保守的RNA病毒。Wassenegger等［4］构建整合了类病毒同源DNA序列的烟草，发现在类病毒复制活跃的植株中，整合类病毒同源DNA序列的胞嘧啶核苷被有效甲基化，而对照类病毒复制缺陷型植株中没有出现此现象。此后，其他研究也表明另外几种植物RNA病毒在其感染的过程中也能引起同源DNA序列的甲基化。由于类病毒和RNA病毒在复制时产生双链RNA，这些实验揭示了dsRNA能引起与其匹配的DNA序列的甲基化。
后期研究表明RdRM需要siRNA的参与，RdRM与RNAi密切相关。当带有GFP基因的RNA病毒感染整合有GFP基因的烟草时，产生了GFP siRNA，GFP转录本为siRNA所降解，GFP基因序列也同时发生了甲基化［5］。这表明GFP siRNA或他们的前体dsRNA同时引起RNAi和甲基化。另外，将高表达GUS反向重复序列的载体导入表达GUS的拟南芥（Arabidopsis）中，GUS转录本被来自重复序列的siRNA降解，同时GUS基因发生了甲基化［6］。
地震烈度
2005, 25(12)左刚 等： 转录水平siRNA介导的基因沉默
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 2005
2siRNA 引发DNA甲基化的机制siRNA引发DNA甲基化在植物中的研究较早。在拟南芥（Arabidopsis）中，DNA甲基化是一个由RNA和位点特异性DNA甲基化转移酶起始的渐进过程。它分为siRNA信号的产生，从头合成DNA（de novo DNA）的甲基化和甲基化的保持三个步骤，如图1所示。
图1拟南芥中RdRM的建立和保持
RDR2/6:RNA dependent rna polymerase 2/6; DCL3: Dicer like 3; SDE2/3: SILENCING DEFECTIVE 2/3; RPD1: RNA polymerase D1; AGO1: Argonaute 1; AGO4: Argonaute 4; DRM1/2:Domains rearranged methyltransferase 1/2; MET1: DNA methyltransferase; CMT3: Methyltransferase chromomethylase 3 ; DDM1:Decrease in DNA methylation 1; KYP: Kryptonite; HDA6:Histone deacetylase
燃煤发电厂activity
产生siRNA信号的途径很多，包括RNA病毒、转座子和重复序列来源以及人工导入的siRNA。在胚乳蛋白FWA基因的串联重复子中，从头合成DNA甲基化需要典型的siRNA产生途径，包括核蛋白Ago4，DCL3 (Dicer like3)，RDR2 (RNA dependent RNA polymerase2) 和SDE4（slencing defective 4）等蛋白组分的参与［7］。在由RNA病毒产生siRNA的途径中，RDR6 (RNA dpendent RNA plymerase 6), SGS3/SDE2 (sppressor of gne slencing 3/slencing dfective 2)和SDE3 (slencing dfective 3)基因的突变，抑制了RNAi，同时也抑制了DNA的甲基化［8］，如图1所示。DCL3途径与由24nt siRNA指导的DNA甲基化密切相关，而Ago1则与21nt siRNA有关，它既能降解mRNA，也能甲基化病毒
或S PTGS (sense pst transcriptional gene silencing)靶向的DNA［9］。此外，还有一些产生siRNA信号的途径尚待研究。
siRNA产生后，与DRM1/DRM2（domains rearranged methyltransferase, DNA methyltransferase 3, DNMT3同源蛋白）作用，导致了DNA特异区域甲基化或组蛋白H3亚基第9个赖氨酸残基K（H3K9）的甲基化。siRNA怎样引导DRM1/DRM2引起特异区域的甲基化，目前尚无定论。来自裂殖酵母的实验表明［10,11］，siRNA可能与一些蛋白组分，包括Ago1，异染质结合蛋白Chp1，Tas3和DRM等组成复合体RITS（RNA induced initiation of transcripitional gene silencing），在siRNA的引导下，复合体使相应的DNA区域包括胞嘧啶 鸟嘌呤核苷酸连续区（称为CG岛），CNG（N：A/T/C/G），CHH（H：A/C/T）中的胞嘧啶核苷C发生甲基化或使相应的组蛋白H3K9发生甲基化。
不同种属，不同DNA区域，甲基化保持需要不同甲基化转移酶。哺乳动物甲基化大多发生在CG岛区域，其保持需要维持甲基化转移酶DNMT1（maintenance DNA methyltransfrase），植物对应的同源甲基化转移酶为MET1(methyltransferase 1)。在某些区域，DDM1（decrease in DNA methylation 1）的突变使得CG岛和H3K9甲基化水平降低，
表明CG岛甲基化的保持需要DDM1参与［12］。一些区域中CG岛甲基化的保持需要HDA6 (histone deacetyase 6)［13］，与MET1和DDM1相比，HDA6与内源性基因座中的甲基化保持更相关［14］。CNG区域和组蛋白H3的赖氨酸Lysine9（H3K9）甲基化的保持需要植物特异性DNA甲基化转移酶CMT3（chromometylase3）和H3K9甲基化转移酶KRYP TONITE（也称SUVH4）的参与［15］。在着丝粒和一些高度甲基化的转座子如Ta3中，CMT3控制着CNG的甲基化。在以反向重复序列和分散序列为特征的DNA区域（如原核DNA）中，CNG和CHH的甲基化的维持较为复杂，需要CMT3，DRM1和DRM2以及siRNA的参与，具体机制尚需进一步阐明［16］。
siRNA在哺乳动物细胞中能否引起DNA甲基化尚存争议。哺乳动物细胞中存在已知的参与RdDM过程的一些功能蛋白组分，暗示RdDM可以发生在哺乳动物中，但是，对RdDM能否发生在哺乳动物中的研究得出了相互冲突的结论。2004年，Svoboda等［17］研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域的从头合成DNA的甲基化。然而，Morris等［18］和Kawasaki等［19］也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛的甲基化，并能引起组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。
3siRNA参与异染质的形成异染质是在细胞间期用碱性染料染较深的DNA复合结构，是无活性的细胞核组分。
flash mtv在DNA水平，异染质由简并逆转录转座子和串联重复序列等组成。异染质区域的典型标志是由SU（VAR）3 9蛋白介导的组蛋白H3亚基的甲基化。一些高度保守的蛋白与异染质有关，包括仅结合于组蛋白H3第9个赖氨酸（H3K9）被甲基化的染质的异染蛋白HP1（Heterochromatin protein 1）和负责染单体的粘附粘蛋白cohesin。裂殖酵母中，Swi6和Clr分别是HP1和SU（VAR）3 9的同源蛋白［20］。
在裂殖酵母中，异染质沉默基因通常发生在着丝粒、端粒和配型区（Mating type loci）。RNAi干涉途径的一些蛋白如Ago，Dicer，RdRP的基因都是单一拷贝基因。在这三种酶突变的RNAi突变体中，H3K9的甲基化程度下降，重复序列相关的Swi6蛋白表达量也下降，同时着丝粒外部转座子重复序列表达阻抑程度也降低，表明RNAi的突变使得异染质阻抑基因表达的程度降低，即RNAi突变使原本被沉默的基因得到一定程度的表达［21］。RNAi的突变导致粘蛋白cohesin表达受阻，使得染体在细胞分裂后期出现拖尾现象，这与异染质高度保守的蛋白clr4 和swi6 突变引起的现象一样，揭示了RNAi在异染
质形成中的作用［22］。RNAi参与裂殖酵母染质形成的另一个有力证据来自于对转基因的研究，位于着丝粒重复序列内的转基因通常不表达，但在RNAi突变株中，它具有表达活性。同样的现象也发生在配型区［23］。这些都说明RNAi在异染质形成中起着重要的作用，RNAi突变会激活原异染质区域中沉默基因的表达。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议