非小细胞肺癌顺铂与DNA甲基化水平改变的相关性研究 摘要 目的 探讨非小细胞肺癌顺铂与DNA甲基化水平改变的相关性。方法 收集2019年1月-2020年1月经本院收治非小细胞肺癌50例为研究对象，均行顺铂化疗方案，采集顺铂化疗前肺泡灌洗液标本，采用亚硫酸盐修饰和RT-PCR方法分析SHOX2和RASSF1A基因启动子的甲基化水平，采集化疗前、后血液样本，通过ELISA方法测定血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达水平，且持续跟踪受试者情况，评估患者SHOX2和RASSF1A基因甲基化水平以及DNMTs浓度与肿瘤进展、顺铂耐药之间的相关性。结果 50例非小细胞肺癌患者经RT-PCR法后结果显示：SHOX2基因启动子甲基化阳性37例，阳性率74.0%，RASSF1A基因启动子甲基化阳性31例，阳性率为62.0%；化疗后DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达水平低于化疗前，差异有统计学意义（P<0.05）；经Spearman分析显示：SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b均呈明显正相关；且SHOX2和RASSF1A基因甲基化水平及DNMTs浓度与肿瘤进展呈明显正相关。结论企业家天地杂志社 顺铂化疗方案可通过抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基转移酶活性来抑制SHOX2和RASSF1A基因甲基化水平，但耐药病例SHOX2和RASSF1A基因甲基化阳性率高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b呈高表达。 好梦何必成真
关键词：非小细胞肺癌；顺铂；DNA甲基化；
Correlation of cisplatin treatment and altered DNA methylation levels in non-SCLC
Zeng jia, Li Qianni, Ren Jing, Zhao Shicai, Zhao Lingyan, Fuziqiao, Ran Kunling, Chen Xuping Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Guangyuan Central Hospital, Sichuan Province 628000
Objective To investigate the correlation of cisplatin treatment and altered DNA methylation levels in NSCLC. Methods Collecting 50 cases of non-small cell lung cancer admitted to our hospital from January 2019 to January 2020 as the study subjects, All patients were treated with cisplatin chemotherapy regimen, Collection of alveolar lavage fluid specimens before cisplatin chemotherapy, The promoter methylation levels of the SHOX2 and RASSF1A genes were analyzed by sulfite modification and RT-PCR analysis, Blood samples were collected both before and after chemotherapy, The expression levels of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b in serum were determined by ELISA, And continuously tracking the treatment of the subjects, To assess the correlation
between the SHOX2 and RASSF1A genes methylation levels and DNMTs concentrations and tumor progression, cisplatin resistance in the patients. Results In 50 non-SCLC patients after RT-PCR, 37 SHOX2 gene showed positive promoter methylation, Positive rate was 74.0%, The RASSF1A gene promoter showed positive methylation in 31 cases, The positive rate was 62.0%; The expression levels of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b were lower than those before chemotherapy, The difference was statistically significant (P
Key words: non-small cell lung cancer; cisplatin; DNA methylation;
非小细胞肺癌是发病率及死亡率均居首位的呼吸道恶性肿瘤。据相关研究报道[1]：我国非小细胞肺癌每年新发例数超60万，死亡人数超72万，且有逐年增长趋势。目前，临床以顺铂化疗方案为一线方案，可一定程度延长患者生存期。但近年来肺癌对顺铂耐药日益突出，既加重病情，延误时机，还可因药物毒副作用产生新的痛苦，甚至加速死亡，顺铂耐受成为晚期肺癌化疗难以突破的瓶颈，故研究顺铂耐受机制成为了肿瘤个体化研究的新热点。随后基因组时代及分子生物学发展，表观遗传学可较好解释顺铂耐受机制，其包括DNA甲基化、非编码RNA表达及组蛋白修饰等，尤以DNA甲基化与肿瘤发生、陆修静
进展密切相关。且由癌症和肿瘤基因图谱（TGGA）数据筛选非小细胞肺癌基因发现SHOX2基因和RASSF1A基因启动子异常可诱导DNA甲基化参与非小细胞肺癌的发生与进展[2]。兹本文检测SHOX2以及RASSF1A的基因的表达，与机体内的DNMTs水平进行相关性分析，以揭示其之间的联系，为相关诊断提供依据。作报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
收集2019年1月-2020年1月经本院收治非小细胞肺癌50例为研究对象。纳入标准：符合《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》[3]中诊断标准；均接受顺铂化疗方案；于顺铂化疗前收集肺泡灌洗液标本，于顺铂化疗前后收集血液样本；临床完整。其中，男29例，女21例，年龄40~78岁，平均（58.34±8.65）岁。本研究获经医院伦理委员会批准并实施。
1.2方法
1.2.1方法
患者均进行顺铂化疗方案，即使用剂量175mg/m2紫杉醇+75mg/m2卡铂，于每周第一d静脉滴注，3周为一周期，持续化疗2~4周期。
1.2.2采用亚硫酸盐修饰和RT-PCR方法
1.2.2.1主要仪器
人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒（上海透景科技股份有限公司）、Applied Biosystems Veriti型PCR仪（美国Thermofisher公司）、DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）、亚硫酸盐修饰试剂盒（美国ZYMO RESEARCH生物公司）、ELISA检测试剂盒（美国Ｒ＆D公司）。
1.2.2.2亚硫酸盐修饰和RT-PCR方法
自动测试将10ml肺泡灌洗液作离心处理（转速：10000rpm，时间：5min）后弃除上清，取下层沉淀提取DNA。经提取DNA直接进行亚硫酸修饰，待修饰后DNA直接用人SHOX2、RASSFIA基因甲基化DNA检测试剂盒（RT-PCR法）检测。DNA提取、修饰及RT-PCR操作均按照试剂盒使用说明书规范进行。
1.2.2.3哈贝马斯交往理论 酶联免疫吸附法（ELISA）法
采集研究对象空腹8h静脉血5mL，于非抗凝干燥无菌真空管内静置1h，2000r/min离心5min，分离血清并分装，－80 ℃存储备检。ELISA法检测2组血清DNMTs水平，操作严格按照说明书进行。
1.3疗效标准
参照2009年实体瘤疗效评价标准（RECIST version 1.1）[4]：分完全缓解（病灶完全消失4周及以上）、部分缓解（病灶体积较基线缩小≥50%，时间≥4周）、SD（病灶体积较基线缩小25~50%，时间≥4周）及疾病进展（不符合以上标准）。次氯酸钠
1.4观察指标
观察SHOX2和RASSF1A基因启动子的甲基化水平，测定化疗前、后血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达水平，且持续跟踪受试者情况，评估患者SHOX2和RASSF1A基因甲基化水平以及DNMTs浓度与肿瘤进展（顺铂耐药）之间的相关性。
1.5统计学分析
采用SPSS25.0软件作处理分析，符合正态分布计量资料以“±s”表示，行t检验，行Spearman分析甲基化水平和DNMTs的相关性，若P<0.05，视为差异有统计学意义。
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