甲基化整体研究思路
DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。研究这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则程高度的甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上；哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶，CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于的其它双核苷酸序列。但在基
因组的某些区域中CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上即所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。 在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。
甲基化研究思路：
1. 寻甲基化位点
1) 甲基化二代测序寻甲基化位点；
2) 对照组和实验组进行甲基化芯片检测，到相关的甲基化位点；乙酸乙酯的性质
3) 一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛；
4) 根据文献寻相关基因的甲基化位点。
2. 验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析
采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。
1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；
日本之家 2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比；
3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围；
4）焦磷酸测序法： 验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。
3. 分析甲基化位点与研究的相关性
根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性。
1) 比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异；
2) 比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异；
4. 验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化
采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。
除了以上4个基础方向外，还有两个特殊方向：
1.省钱思路： 老数据二次挖掘
第一步：先从原有的表达谱芯片数据或转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶；
第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进行qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变；
第三步：在细胞或动物模型中对这些基因进行敲低和过表达， qPCR和WB检测基因表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平；
第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化；
第五步：到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救；
第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证；
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第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。
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儿童2.高分思路：研究甲基化修饰差异基因
第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、WB等方法验证，此外到m6A有差异的基因；
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第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第一步中感兴趣的m6A有差异的靶基因；
第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进行恢复；
第四步：对靶基因上motif进行点突变后进一步确认直接受到甲基化酶调控；
第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。
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