现物医学biomecLcnjournals Progress in Modem Biomedicine VoL21 NO.l JAN*2021• 21•doi: 10.13241/jki.pmb.2021.01.004
姜黄素对db/db小鼠基因组D N A甲基化的影响* 程晓夏文华姜羽曲坤闻颖八
(哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室黑龙江哈尔滨150081)
摘要目的：观察姜黄素对2型糖尿病模型db/db小鼠糖尿病症状的改善作用，并从表观遗传角度分析其对小鼠外周血D N A甲基 化水平的影响。方法:2型糖尿病模型db/db小鼠随机分为糖尿病组和姜黄素干预组（给予250 m g/kg姜黄素溶液），连续灌胃8 周。OGTT检测葡萄糖耐量，ELISA法测定空腹胰岛素并计算HOMA-IR和HO M A-p,RRBS技术检测外周血基因组D N A甲基化 水平。结果：与糖尿病组相比，姜黄素干预小鼠的血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR显著降低，葡萄糖耐量显著改善(P C0.05)；且小 鼠外周血基因组启动子区、C G I岸和5'-非编码区C p G甲基化水平显著降低(P C0.05)；对两组间差异甲基化基因进行功能富集 分析，筛选出前10位显著富集的可能与2型糖屎病相关的差异基因包括Hdac7、M icalll、Vangl2、Dhcr24、Kcnj8、Gnas、Tcf712、Dgkh、D lg a p l和P lekhg4:.结论：姜黄素能够改善db/db小鼠的葡萄糖耐量及胰岛素抵抗，并且其外周血中存在显著低甲基化改 变，提示姜黄素可能是通过抑制糖尿病小鼠中某些基因的异常甲基化修饰而发挥抗糖尿病作用。 关键词:2型糖尿病模型db/db小鼠;D N A甲基化；差异甲基化区域；姜黄素
中图分类号：尺丨5丨.2;11587.丨文献标识码：八文章编号：1673-6273(2021)01-21-06
Effects of Curcumin on Genomic DNA Methylation in db /db Mice*
CHENG Xiao, XIA Wen-hua, JIANG Yu, QUKun, WEN Ying^
(Department o f N utrition and Food Hygiene, School o f P ublic Health, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150081, China)
A B S T R A C T Objective:To observe the effect of curcumin on diabetes symptoms and analysis o f its effect on the DNA methylation levels in peripheral blood o f type 2 diabetes model db/db mice from the perspective o f epigenetics. Methods:Type 2 diabetes model db/db mice were randomly divided into diabetes mellitus group and curcumin intervention group (given 250 mg/kg curcumin), and followed by gavage for 8 weeks. Glucose tolerance was measured by OGTT, fasting insulin was detected by ELISA and HOMA-IR and HOMA-p indexes were calculated. The genome-wide methylation detection of peripheral blood DNA was performed using RRBS. Results:Compared with the diabetes mellitus group, curcumin significantly reduced blood glucose, fasting insulin and HOMA-
IR, and improved glucose tolerance (P<0.05). CpG methylation levels in the genomic promoter, CGI-shore and 5'-non-coding region of peripheral blood was significantly lower with curcumin (P<0.05). The functional enrichment analysis were performed on the differential methylated genes, and the top 10 significantly enriched differential genes that may be associated with type 2 diabetes including Hdac7, Micalll, Vangl2, Dhcr24, Kcnj8, Gnas, Tcf712, Dgkh, Dlgapl and Plekhg4. Conclusion:Curcumin can improve glucose tolerance and insulin resistance in db/db mice, and there is a significant difference o f DNA methylation in peripheral blood, suggesting that curcumin may play an anti-diabetic role by inhibiting the abnormal DNA methylation level o f certain genes in diabetic mice.
Key words:Type 2 diabetes model db/db mice; DNA methylation; Differentially methylated regions; Curcumin
Chinese Library Classification(C L C):R151.2; R587.1 Document code:A涉日
Article ID: 1673-6273(2021)01-21-06
刖目
据国际糖尿病联盟发布的最新报告，2017年全球糖尿病 患者高达4.25亿，其中中国糖尿病患者以1.14亿高居首位。若 不加干预，预计到2045年全球会有将近7亿糖尿病患者％ 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2D M)是一种由遗传与环 境因素共同作用的慢性代谢紊乱性疾病p i。大量研究表明多种 环境危险因素都能通过改变T2D M相关候选基因D N A甲基 化修饰状态显著地增加T2D M的患病风险IM。D N A甲基化在机体内在遗传因素和外在环境因素之间起着重要的连接作用，与日益增加的T2D M患病率密切相关。因此，积极寻能够调 节D N A甲基化修饰改变的靶点药物，是防治T2D M的一 个重要思路。
姜黄素是一种具有降血脂、抗炎、抗氧化及抗增殖等作用 的天然植物化学物，对癌症、糖尿病和动脉粥样硬化等多种慢 性疾病都具有潜在的作用[51。不少研究发现姜黄素作为一 种有效的D N A甲基化抑制剂已被广泛用于癌症研究中，它能对人宫颈癌细胞和胃癌细胞中pl6抑癌基因的高甲基化
*基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（H2018008)
作者简介：程晓（丨993-)，硕士研究生，主要研究方向：慢性病的营养防治，E-mail:A i r J729@163.c o m A通讯作者：闻颖，博士，教授，电话：139********, E-mail:wenying_alice@ 丨63
(收稿日期:2020-05-31接受日期:2020-06-25)
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水平发挥去甲基化作用，恢复其基因表达，显著抑制癌细胞的 生长与增殖因此，姜黄素发挥抗癌作用的机制之一就是 D N A去甲基化作用，然而姜黄素能否通过D N A去甲基化作用 来调节T2D M相关基因的甲基化修饰水平，从而改善T2DM，目前尚未见相关的研究报道。
本课题采用db/db小鼠作为T2D M动物模型，观察姜黄素 对db/db小鼠糖尿病症状的改善作用，并通过简化表观重亚硫 酸盐测序技术（Reduced representation bisulfite sequencing, R R B S)检测姜黄素干预后小鼠外周血中D N A甲基化改变图 谱，出T2D M相关的差异甲基化基因，初步探讨姜黄素能否 通过影响糖尿病小鼠基因组甲基化修饰水平来发挥抗T2DM 的作用，为姜黄素改善T2D M的分子机制研究提供新思路。
1材料与方法
l.i材料
7周龄SPF级雄性C57BLKS db/db小鼠（体重38-44 g)，购于南京君科生物T程有限公司，许可证号：SCXK (苏）2016-0010；姜黄素（纯度2 70%)购于美国Sigm a公司；羧甲基 纤维素钠(CM C-Na)和水合氯醛购于哈尔滨化T化学试剂厂；血糖仪和血搪试纸购于德国R oche公司；小鼠胰岛素酶联免疫 吸
附试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技公司；Qiagen DNeasy Blood & Tissue 试剂盒购于德国 Qiagen 公司；Nanodrop 2100超微量分光光度计购A美国赛默飞世尔公司；SpectraMax M2酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司。
1.2方法
丨.2.1实验动物分组与标本采集 将20只db/d b小鼠在室温(23±2-C )，相对湿度(55±5%), 12 h光照/黑暗循环的饲养条件 下进行适应性喂养，自由进食和饮水。喂养一周后，测定小鼠 空腹血糖值为23.14±4.82 mmol/L。再按体重和血糖随机分为 糖尿病组（Diabetes mellitus group, D M组）和姜黄素干预组 (Curcumin treatment group,C U R组），每组 10 只。C U R组以 250 mg/kg C U R溶于1%C M C-N a灌胃，D M组给予相应量的 1%C M C-N a，连续干预8周，每周记录小鼠随机血糖水平。实 验结束后，10%水合氯醛麻醉小鼠，心尖采血置于E D T A抗凝 管内,4°C保存。
1.2.2 O G T T测定葡萄糖耐受情况实验第7周末，小鼠禁食 过夜后予以2 g/k g葡萄糖溶液灌胃，分别在0,15,30,60,90, 120和180 m i n时采集小鼠尾静脉血样本用罗氏血糖仪检测并 记录血糖值。
1.2.3 E L I S A法检测空腹胰岛素水平及稳态模型评估采用 小鼠胰岛素E L I S A试剂盒测定血浆胰岛素水平，具体实验步 骤参照说明书进行。根据测得的空腹血糖(Fasting blood glucose, F B G)和空腹血桨胰岛素（Fasting plasma insulin,FINS)，采用稳 态模型计算胰岛素抵抗指数（Homeostasis model
assessment-insulin resistance index, H O M A-1R)和胰岛 p 细胞功能指数(Homeostasis model assessment-islet (3c e l l function index, H O M A-p)来评估小鼠的胰岛素抵抗和胰岛p细胞功能。计算 公式如下：
HOMA-IR=[FINS(mIU/L)xFBG(mmol/L)]/22.5
H O M A-p=[20xFINS(m I U/L)/(F B G(mmol/L)-3.5)]1.2.4 RRBS法检测外周血D N A甲基化水平从两组内各随机选取5份外周血样本，采用北京诺禾致源有限公司的R R B S 技术进行全基因组甲基化检测。实验过程如下：采用Qiagen DNeasy Blood &Tissue试剂盒提取小鼠外周血D N A，进行质 量和浓度的检测。R R B S测序原理及文库制备如先前所述i s_9i，通过超声、末端修复和腺苷酸化等处理将D N A片段化.再将这 些片段进行重亚硫酸盐修饰，对所得的单链D N A片段进行 P C R扩增。通过Agilent 2100和Qubit® 2.0来确定文库的质量 和浓度。最后，使用Hlumina Hiseq 2500平台并配对末端150 bp 策略进行测序。通过D S S软件鉴定的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,D M R)进行生物信息学分析 丨1。1。 根据 D M R在整个基因组中的分布，定义出D M R关联基因，通过 GOseq R软件""和K O B A S软件叫对关联基因进行基因本体 论(Gene ontology,G O)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,K E G G)富集分析，以校正 Z5值<0.05来确定显著富集的G O条目和信号通路。
1.3统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件对两组样本甲基化测序结果进行 W a l d检验，结合D S S软件，鉴定得到D M R。D M R判定条件：P<〇.〇5的差异甲基化C碱基比例大于该区域总C碱基的 50%，该区域C碱基数目大于3个，长度大于50bp，计量资料 采用表示，统计方法为t检验,P<0.05为差异具有统计学 意义。
2结果
2.1姜黄素对db/d b小鼠随机血糖及葡萄糖耐量的影响
与D M组相比，姜黄素干预5周后db/db小鼠的随机血糖 持续降低，差异具有统计学意义(P<〇.〇5)，见图1A。O G T T结 果显示姜黄素干预小鼠在第0、90和180 m i n时血糖水平较 D M组有显著降低(P C0.05)，表明姜黄素能改善db/db小鼠葡 萄糖耐量受损情况，见图1B。
2.2姜黄素对db/d b小鼠FINS、HOMA-IR及HOMA-p的影响
与D M组相比，姜黄素能够M著降低db/d b小鼠的FINS 水平和H O M A-I R指数(f<0.01 )，而H O M A-p指数虽呈增高 趋势，但差异无统计学意义(P>〇.〇5)，见图2。
2.3两组小鼠外周血D N A甲基化的聚类热图分析和功能区域分布
通过绘制聚类热图来展示两组小鼠外周血D M R的甲基 化情况。C U R组与D M组小鼠比较某些区域颜不同，说明两 组小鼠甲基化水平存在差异性，见图3。与D M组相比，姜黄素 干预db/d b小鼠外周血基因组的启动子、C G I岸和5’-非编码 区域C p G甲基化水平均显著降低(P<0.05>，见表1。
2.4两组小鼠D M R关联基因的G O富集分析
将232个低甲基化D M R关联的150个差异甲基化基因 进行G O分析，富集得到了 3107条下调G O条目，其中680条是显著富集的。再从结果中搜索包含T2D M相关关键词的GO 条目，共筛选出366条G O条目，其中114条有显著性差异 (P C0.05)。前20个显著富集的与T2D M相关G O条目结果如 图4所示，在生物学过程中富集的有MAPK级联反应、W rit信 号通路的负调控、甘油三酸酯代谢过程的调节、葡萄糖稳态、胰
0■V I I
8 9 10 0 50 100 150
Time (min)
图1姜黄素对db/d b小鼠随机血糖及葡萄糖耐量的影响
Fig. 1 Effects of curcumin on random blood glucose and glucose tolerance in db/db mice A: Changes in ra n d o m blood glucose levels in two groups of mice; B: O G T T results in two groups of mice.
Note: Data were expressed as x±s,n=10. *P<0.05, compared with the D M group.
A
21.0-
B C
D M DM
**
CUR DM
图2姜黄素对db/d b小鼠F I N S水平及稳态模型指数的影响
Fig.2 Effects of curcumin on fasting plasma insulin and homeostasis model indicators in db/db mice A: T h e fasting plasma insulin levels in two groups of mice; B: H O M A-I R index; C: H O M A-p inde
x.
Note: Data were expressed as r c±5,n=10. **P<0.01, compared with the D M group.
Heatmap o f CUR_v*_DM CG DMRs
图3两组小鼠外周血D N A甲基化的聚类热图分析
Fig.3 Th e cluster heatmap analysis of D M R methylation levels in two
groups of mice 2.5两组小鼠D M R关联基因的KEGG富集分析
对DM R关联基因进行KEGG分析，富集得到了 68条下 调通路，其中15条通路有显著差异。再从结果中搜索包含 T2D M相关关键词的信号通路，共筛选出28条，其中4条有显 著差异(P<〇.〇5)。前10条富集的与T2D M相关KEGG通路 结果如图5所示，主要涉及W nt信号通路、内分泌抵抗、R as信 号通路、甘油脂代谢和E R B B信号通路等。
2.6两组小鼠外周血的差异甲基化基因
结合G O和K E G G分析结果，共筛选得到68个可能与 T2D M相关的差异低甲基化基因。按其显著性
进行排序，前10位差异低甲基化基因分别是：组蛋白去乙酰化酶U类 (Hdac7)、MICAL类锌指蛋白 11 (M icalll)、VANGL平面细胞 极性蛋白2(Vangl2)、24-脱氢胆固醇还原酶(Dhcr24)、钾内流 通道亚家族J成员8 (Kcnj8)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋 白）,a亚基(Gnas)、转录因子7样2(Tcf712)、二酰基甘油脂酶 (D gkh)、D LG相关蛋白l(D lg ap l)、pleckstrin同源结构域包含 家族G成员4( Plekhg4)，详细结果见表2。
3讨论
h i
y」
3 4 5 6
Time (weeks)
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岛素代谢过程等；在分子功能中富集的是类固醇激素受体活 性、磷脂酰肌醇3-激酶结合和脂质结合；在细胞组成中富集的 是p-catenin-TCF7L2复合物和胰岛素受体复合物。
近年来表观遗传修饰直接或间接参与T2D M的发病机制 受到了众多关注和重视。不少研究表明T2D M的多种危险因素，即低体力活动、年龄、遗传易感性和不良饮食等|41，是改变D N
金纳米颗粒
A
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表1不同功能区域中D M R甲基化水平(n=5,.r±5)
Table 1 D M R methylation levels in different functional regions (n=5, .r±s)
Groups C G I C G I s h o r e promoter exon intron T S S utr3utr5
D M8.02±0.2426.98±0.2917.60±0.4734.05±0.2150.26±0.2062.92±0.1767.67±0.80 5.18±0.08
C U R8.12±0.6526.07±0.81*16.47±0.33*33.27±1.0049.89±0.9062.75±0.7768.35±0.72 4.97±0.16* Note: compared with the
lf398D M group, *P<0.05.
M A P K cascade
negative regu lation o f e p ith e lia l..!
regulation o f G T P ase.. I
regulation o f m etabolic p ro cess
negative regulation o f c an on ical.,
regulation o f t riglyceride,
neutral Upid m etabolic process
steroid horm one m ediated.,
negative regu lation o f..I
—po sitive regulation o f E R K1 a
农response to Upid
g glu cose hom eostasis
insulin m etabolic p ro cess negative regulation o f t riglyceride.
transm em brane receptor p r o te in.. phosphati(fylinositol 3-kin ase binding
Upid binding steroid horm one receptor activity
beta-catenin- TC F7L2 com plex]
insulin receptor com plex □ C ellular C om ponent S M elocular F unction ■ B iological P rocess
0 48 12 16 202428 3236
基因数目/个
陈道学>http代理图4两组小鼠D M R关联基因的G O富集分析
Fig.4 G O enrichment analysis of DMR-associated genes in two groups of mice
5 1
chinese男同志movies青年
K E G G通路
图5两组小鼠D M R关联基因的K E G G富集分析
Fig.5 K E G G enrichment analysis of DMR-associated genes in two groups of mice
甲基化和其他表观遗传模式的重要因素，能够影响T2D M相 关候选基因的启动子和C p G岛附近的C p G位点发生D N A甲基化修饰改变而调节相应基因表达[msi，进而影响T2D M进展。一般来说，基因组D N A的高甲基化状态通常与基因表达失活 相关，而基因表达恢复与去甲基化作用相关[141。因此，D N A甲基化改变为T2D M早期诊断和提供了可能途径。
姜黄素是从中药姜黄中提取的一种价格低廉且毒副作用 小的天然多酹类物质，能够显著改善T2D M大鼠的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗™。越来越多的研究表明姜黄素具有D N A 去甲基化作用，它不仅能够诱导癌症细胞系基因组整体低甲基 化改变[n i，还能通过改变几个重要基因的高甲基化修饰水平来 抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，抑制大鼠前列腺癌，结肠癌和肺 癌等的发生【6]。此外，有研究者用姜黄素干预肝纤维化模型小鼠 6周后进行全基因组甲基化检测，筛选出8个与肝纤维化形成 密切相关的差异低甲基化基因，表明姜黄素可能通过降低某些 基因D N A
甲基化水平来发挥抗肝纤维化作用™。但姜黄素对
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表2前10位显著的低甲基化DMR关联的差异基因
Table 2 T h e top 10 most significant hypo-methylated DMR-related differential genes
G e n e n a m e functional D M R position Diff. Methylation level
G O e n t r y/K E G G pathway regions Start E n d(%)
Hdac7Promoter978449039784518635.18Regulation of metabolic process Micalll Intron791264067912655018.88Lipid binding
Vangl2Intron17200810117200816418.65W n t signaling pathway Dhcr24Promoter10656021610656035814.24Regulation of metabolic process Kcnj8exon N intron ^14257039814257049512.58c G M P-P K G signaling pathway
Gnas
promoter、e x o n、
C G I s h o r e 17432874317432898212.54
Regulation of metabolic process、
Response to lipid
Glucose homeostasis、Insulin metabolic
Tcf712Intron559148635591509610.94process xBeta-catenin-TCF7L2 complex /W n t
signaling pathway、Hippo signaling pathway
Glucose homeostasis%Neutral lipid metabolic D g k h promoter x intron787258217872593210.93process /Glycerolipid metabolism、
Glycerophospholipid metabolism
Dlgapl Promoter70516364705164269.31
Regulation of metabolic process /
Glutamatergic synapse
Plekhg4Promoter1053788081053789169.14Regulation of metabolic process
糖尿病相关基因甲基化水平影响尚不清楚。
db/d b小鼠是因瘦素受体缺陷而自发形成的动物模型，与 人T2D M有许多共同特征，是目前研究最广泛的T2D M动物 模型之一。本研究用姜黄素干预2型糖尿病模型db/d b小鼠8 周，并对其外周血进行全基因组D N A甲基化检测，结果显示姜 黄素能使小鼠的血糖和空腹血浆胰岛素水平显著下降，葡萄糖 耐量和胰岛素抵抗得以改善，同先前文献研究结果一致w1热 图结果发现两组小鼠在某些区域颜不同，组间D N A甲基化 水平存在差异性，进一步统计不同功能区域的甲基化水平发现 姜黄素能够诱导db/d b小鼠基因组启动子区、C G I岸和5’-非 编码区的甲基化水平降低，具有抑制db/d b小鼠基因组D N A 甲基化水平的作用。对本研究测序结果进一步分析筛选出受姜 黄素影响的150个低甲基化状态的差异基因，再结合甲基化水 平差异程度和生物信息学分析结果，发现68个可能与T2D M 发病机制相关的基因，其中前10位显著富集的差异基因见表 2，它们所参与的代谢过程和信号通路在T2D M的发生发展中 发挥着重要的作用。据报道Tcf712基因在p细胞增殖及胰岛 素分泌中起重要作用在糖尿病db/d b小鼠中Tcf712基因表 达显著降低糖尿病小鼠胰岛中Tcf712启动子异常甲基化
以及T2D M患者外周血中Tcf712内含子显著高甲基化叭其基 因表达显著降低，同时空腹血糖、总胆固醇和低密度脂蛋白水 平均与Tcf712启动子特定C p G位点的甲基化有关™;Gn a s基 因是P细胞胰岛素
分泌的关键基因，其在糖尿病性胰岛中表达 低于正常胰岛M，GnaS基因甲基化增加会影响其蛋白表达水 平，导致脂代谢紊乱，与妊娠期糖尿病的发展密切相关[271; Dhcr24基因在脂质代谢和胆固醇合成过程中起重要的调节作 用，糖尿病鼠中其表达水平下降导致胆固醇合成失调，进而引 起胰岛素抵抗m;D g k h也被报道为潜在的糖尿病候选基因，作为胰岛素信号转导相关基因，其在T2D M大鼠中表达是降低 的™；长期处于高血糖状态下还会下调W nt信号通路中Vangl2基因表达[29]。
本研究结果初步证明了姜黄素可能通过抑制某些T2D M 相关基因的甲基化修饰来发挥其抗糖尿病作用。但因为本研究 的某些局限性其确切机制尚需进一步验证。后续应采用定量 P C R检测相关基因m R N A表达水平，更深人研究姜黄素改善 T2D M的表观遗传学机制，为探索姜黄素防治T2D M的分子机 制研究提供了一个新思路。
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