黑龙江八一农垦大学学报第22卷
素，牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属。完整的病毒粒子由外，中和内三层蛋白衣壳组成，11节段双股RNA 包裹于内层衣壳，除第十一段RNA 编码两个蛋白外，其余每段均编码一种蛋白，即轮状病毒基因组共编码6种结构蛋白（VP1-4，6和7）和6
种非结构蛋白（NSP1-6）[1]。现在轮状病毒的分型标准是以每段基因编码区核苷酸的同源性为基础来进行
的，即轮状病毒的基因型为11个不同基因分型的总
和。而通常以轮状病毒基因节段4和7编码的能刺激机体产生中和性抗体，介导病毒进入细胞的蛋白 敏感蛋白VP4和糖蛋白VP7的基因型[2]来表示其基因型。最新的分类标准规定当VP4或VP7编码区的核苷酸同源性大于80%时，为同一P 基因型或G 基因型[3]。目前，已经发现了24个G 基因型和33个P 基因型[4]，其中腹泻牛中报道了10个G 型（G1-3、G5-8、G10、G11、G15）和6个P 型（P6［1］、P7［5］、P8［11］、P11［14］、P ［17］、P ［21］），健康牛中发现了轮状病毒G21P ［29］型和G24P ［33］型[3-7]。已有的研究表明较常见的牛轮状病毒G 和P 组合为G10P ［11］，
东北饲料
G6P ［5］或G6P ［1］[8]
。与国外相比，在我国零星有G6
型和G10型牛轮状病毒被发现[10，11]
。为响应国家发展
谢金鑫，侯喜林，董华兴，柳强，张佩鑫，刘鹏，侯美如
（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）
摘
要：为了解轮状病毒在腹泻奶牛中的流行情况，从2008年12月到2009年6月，
我们在大庆某牛场共收集117份小于7日龄新生牛的腹泻标本，用A 轮状病毒抗原诊断试剂盒对腹泻标本进行检测；应用MA104细胞对阳性标本进行分离，扩增细胞分离株保护性抗原VP7基因，
并对该基因进行序列分析。腹泻标本中有10份标本（8.5%)经A 轮状病毒抗原检测试剂盒确认为阳性，成功的分离出一株轮状病毒，命名为：DQ-75，分离株DQ-75VP7基因的基因型是G10，该分离株中VP7基因与现有G10型轮状病毒毒株的VP7编码区氨基酸的系统进化树分析提示其可能是随着奶牛的购入而进入我国。关键词：牛轮状病毒；基因型；G10中图分类号：S482
The Isolation and Its Genotype Identification of Neonatal Bovine Rotavirus
Xie Jinxin ，Hou Xilin ，Dong Huaxing ，Liu Qiang ，Zhang Peixin ，Liu Peng ，Hou Meiru （College of Animal Science and Technology ，Heilongjiang Bayi Agricultural University ，Daqing 163319）
Abstract:In order to investigate the situation of rotavirus strains circulating in diary farms ，a total of 117fecal specimens were collected from diarrhea calves under 1week -age on a diary farm in Daqing regiona from Decmber 2008to June 2009.Faecal specimens were tested by a Rotavirus Group A Diagnostic Kit ，rotavirus positive samples was isolated by MA104cell ，VP7sequence of the rotavirus was amplified and analyzed.The results showed that ten specimens （8.5%）were detected to be positive by a Rotavirus Group A Diagnostic Kit ，one of rotavirus strains was isolated successfully by MA104cell ，genotype of the rotavirus strain was G10.Amino acid sequence and Ph
ylogenetic analysis among the rotavirus and the existing G10genotype rotavirus indicated that the rotavirus could be introduced into our country with the import of bovine.Key words:bovine rotavirus ；genotype ；G10
收稿日期：2010-05-17
作者简介：谢金鑫（1982-），男，黑龙江八一农垦大学2007级研究生。通讯作者：侯喜林，男，教授，硕士研究生导师，E-mail ：xly_hou@yahoo 。
黑龙江八一农垦大学学报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University 22（5）：56~59西沃里
Oct.2010文章编号：1002-2090（2010）05-0056-04
第22卷第5期2010年10月文献标识码：A
第5期
奶牛产业的号召，大庆近几年不断地从加拿大、澳大利亚购进优良奶牛，本次试验的目的是对大庆地区某大型奶牛场中进口奶牛进行轮状病毒流行病学调查，了解该牛场轮状病毒的基因型，为该牛场轮状病毒性腹泻的预防服务。
1材料和方法
1.1试剂
A轮状病毒诊断试剂盒购于OXOID，Viral Nucleic Acide Extraction KitⅡ与Gel Extraction Kit 购于Geneaid，ExTaq酶购于宝生物，反转录试剂盒AMV，PGEM-T Easy Vector和T4DNA ligase购于Promega，DMEM液体培养基，胎牛血清，胰酶以及细胞瓶购于GIBICOL，其它在RT-PCR中所使用的试剂在这里不作介绍。
1.2标本的收集
国庆50周年2008年12月至2009年6月，117份小于7日龄荷斯坦新生牛的腹泻标本收集于大庆某牧场。
1.3标本的处理及ELISA检测
腹泻标本被病毒处理液稀释成10%的悬液，悬液经过漩涡震荡后，以13000ⅹg离心5min，取上清进行A轮状病毒的抗原ELISA检测，步骤参见英国DakoCytomation公司生产的IDEIA TMRV检测试剂盒。检测阳性的标本稀释液在RT-PCR扩增之前储存于-80℃，阴性的标本用于其它相关腹泻病毒的检测。
1.4病毒的细胞分离
用DMEM维持液（含双抗）将轮状病毒阳性标本稀释成10%的悬液，4℃过夜，13000rpm离心10min，上清液用0.20μm滤膜过滤1，将上清用胰酶于37℃处理1h，胰酶终浓度为20μg·mL-1，将长到80%的单层MA104传代细胞（25cm2的细胞瓶）用Hanks轻洗3遍，将胰酶处理的标本处理液接种于细胞培养瓶内，于37℃吸附2h（30min晃动一下），最后加入4.5mL含5μg·mL-1胰酶的无血清DMEM维持液，于37℃5%CO
2
细胞培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE），出现细胞病变的进行照相记录，无细胞病变的接毒72h后收毒，继续盲传[1]。
1.5RNA的提取及RT-PCR扩增
取200μL阳性标本悬液用于病毒核酸的提取，操作步骤参见Geneaid的Viral Nucleic Acide Extraction KitⅡ的说明书，VP7的扩增采用一步法PCR：1，取8μL提取的核酸，上、下游引物[9]各1μL 加于PCR管中，98℃5min，迅速放入冰中，待冷却后加入0.25μL的ExTaq，5μL的10×Buffer，0.2μL 的AMV反转录酶，1μL的10Mm的dNTP以及33.55μL的无RNA酶水。反应程序为：42℃，1h；98℃，1min；94℃，3min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；循环数为30。对目的条带进行回收，连接，送于上海生工测序。
1.6序列分析
序列的分析运用了DNASTAR软件和BLAST (NCBI)。系统进化树由MEGA version4.0.1软件构建。
2结果
2.110份标本(8.5%)被A轮状病毒病原检测试剂盒确认为阳性，表明轮状病毒是引起该牛场新生牛腹泻的重要病原。我们用MA104细胞只分离出了其中的1株，命名为DQ-75。
2.2分离株DQ-75基因VP7的序列分析
分离株DQ-75基因VP7的全序列为1062个核苷酸，编码区从49bp到1029bp，编码981bp，GenBank登录号为：GU144587。分离株DQ-75和已发现的24个G基因型的VP7编码区核苷酸同源性分析了解到：DQ-75株与G10型的轮状病毒分离株的同源性大于85.9%，但与另外23个G基因型的同源性不高于75.6%（表1），根据轮状病毒基因VP7编码区核苷酸同源性大于80%为同一G型的原则，我们得出：分离株DQ-75为G10型轮状病毒。
图1轮状病毒细胞病变
Fig.1CPE of rotavirus
谢金鑫等：新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定57
黑龙江八一农垦大学学报
第22卷
分离株DQ-75和已有的G10基因型轮状病毒的编码区氨基酸构建系统遗传进化树展示：分离株DQ-75与G10型牛、猪轮状病毒株形成一个进化分支；而G10型羊、人和马轮状病毒株构成了另一个平行进
化的分支。第一个进化分支中分离株DQ-75与北美G10型牛轮状病毒株MX001、B223、2292B 进化关系最近，构成一个小的分支，其中与墨西哥分离株
MX001同源性为98.2%，与另两株美国分离株B223、
2292B 的同源性分别为98.5%、97.2%（表1），但与G10型泰国分离株KK3、澳大利亚分离株VICG10.01亲缘关系较近，同源性分别为97.2%、98.2%（表1），分离株DQ-75与G10型日本分离株61A 、P343，印度分离株B75，泰国分离株A44亲缘关系较远，同源性均小于97.2%。流行株B223在同一分支（图2）。
参考株GenBank 登录号为：Wa （G1，K02033），S2（G2，M11164），RRV （G3，M21650），HOCHI （G4，AB012078），LL3354（G5，），NCDV （G6，M12394），Ch -2（G7，X56784），Sun9（G8，AB158431），116E （G9，L14072），YM （G11，M23194），L26（G12，M58290），L338（G13，D13549），CH3（G14，D25229），Hg18（G15，AF237666），EW （G16，U08430），Ty -1（G17，S58166），PO -13（G18，D82979），Ch-1（G19，AB080738），Ecu534（G20，EU805775），AzuK-1（G21，AB454421），Tu-2E10（G22，EU486973），Phea17655-Hun-08（G23，FN393056）和Dai-10（G24，AB13837）。
表1分离株DQ-75与现有24个G 基因型轮状病毒毒株VP7编码区核苷酸的同源性
Table 1homology of the isolated strain DQ-75and the existing 24G genotype rotavirus VP7encoding area of nucleotide
Strain B2232292B VICG10.01MX001KK361A T01TR A44P343B75A64Erv2Lamb-NT
Other G types strain a
Species of origin
Bovine Bovine Bovine Bovine Bovine Bovine Bovine Bovine Porcine Bovine Human Equine Lamb
G type G10G10G10G10G10G10G10G10G10G10G10G10G10
nt identity/%
96.895.595.494.893.891.991.691.591.591.486.686.285.964.6-75.6
aa identity/%
98.597.298.298.296.696.697.596.395.797.296.396.395.756.4-85.0
钛板Accession no X57852U14996GQ352366FJ217204D01056X53403FJ598312D01055U35850AF386918EF672567DQ981476FJ031029
DQ-75
图2分离株DQ-75中VP7和现有G10型轮状病毒毒株的VP7编码区氨基酸构建的系统遗传进化树。
参考株GenBank 序列号见表1。
Fig.2
The systematic inheritance phylogenetic tree of VP7in isolated strain and VP7encoding area of the existing G10-type rotavirus which is established by amino acid.The number of reference strains GenBank is shown in Table 1.
58
第5期
3讨论
收集于大庆某大型奶牛场的10份腹泻标本被检测出轮状病毒，表明轮状病毒是引起该牛场新生牛腹泻的重要病原，用细胞分离到其中的一株（图1），并命名为：DQ-75，分离株DQ-75和已发现的24个G基因型的VP7编码区核苷酸进行同源性比较，我们发现分离株DQ-75和G10型轮状病毒分离株的编码区核苷酸同源性大于85.9%，根据轮状病毒VP7最新分类标准：编码区核苷酸同源性大于80%为同一基因型[4]，分离株DQ-75是G10型轮状病毒。以DQ-75株和已发现的G10基因型轮状病毒株的VP7编码区核苷酸构建系统遗传进化树展示分离株DQ-75与基因型G10的北美分离株MX001、B223、2292B亲缘关系最近，形成一个小的进化分支，而与分离与其它地区的G10型分离株亲缘关系较远（图2）。
试验的分离株是G10型轮状病毒，根据国内外的相关文献，全球牛轮状病毒的流行以G6和G10为主[8，10，11]，我们会陆续对其余9株未适应细胞生长的轮状病毒株进行VP7基因型鉴定，同时也会对牛场内的新生牛及其它年龄段的奶牛进行A轮状病毒的病原学调查，了解该牛场中轮状病毒VP7基因的基因型组成及G10型轮状病毒在一年中的流行情况，进而了解轮状病毒在牛场中危害程度，为未来轮状病毒性腹泻的防控服务。引起我们关注的是大庆分离株DQ-75和美国流行株B223、2292B以及墨西哥流行株MX001形成一个小的进化分支，进化关系最近，同时了解到该牛场每年都从北美的加拿大引进奶牛，国内只有常继涛[11]报道了1株G10牛轮状病毒，综上，我们推断牛轮状病毒分离株DQ-75可能是随着奶牛的购入而引进我国，DQ-75株轮状病毒的发现给我国进出口检疫部门敲响了警钟，DQ-75的发现也提醒我们对标本进行其他病毒的筛查，调查是否牛场中存在其它腹泻相关病毒，是否还有其它病毒被引入。
本研究阐述了轮状病毒在大庆某大型奶牛场中的流行情况，是该牛场新生牛腹泻的重要病原，细胞成功地分离出一株G10型牛轮状病毒株DQ-75，分
离株DQ-75与现有的G10型轮状病毒构建的系统遗传进化树分析提示该分离株可能是随奶牛的购入而引入我国。
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谢金鑫等：新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定59
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