南美白对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）幼虾 和杜拉对虾（Ｆａｒｆａｎｔｅｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ）
地理隔离株的免疫比较
Donald V. Lightner 等
(美国亚利桑那州大学兽医学和微生物学系)
［摘 要］ 白斑综合病病毒（WSSV）是一种对对虾养殖危害性最大的病原体之一。它广泛
分布在大多数养殖对虾的亚洲国家以及墨西哥湾、美国。我们采用南美白对虾（Litopenaeus
vannamei）幼虾和杜拉对虾(Farfantepenuaeus duorarum)稚虾对六种WSSV地理隔离株的病
毒性进行免疫比较。这6组WSSV地理隔离株分别取自中国、印度、泰国、美国德克萨斯 州、南卡来罗纳州的对虾以及美国国家动物园养殖的淡水龙螯虾。为了进行免疫性试验研
究，我们把病毒感染组织接种到南美白对虾幼虾和杜拉对虾稚虾中。通过组织检查结果证实 碳酸镁
发生WSSV感染。在这次免疫性试验中，被六组WSSV地理隔离株感染的南美白对虾幼虾
的死亡率为100%。其中，德克萨斯州的病毒比其它的病毒厉害，最快引起实验对象死亡， 而淡水龙虾的WSSV病毒致病性最慢。与之形成显著对比，杜拉对虾稚虾的死亡率仅为
35%~60%，并且对不同的病毒其死亡率也有所不同。值得注意的是，杜拉对虾对德克萨斯
州病毒感染也是最为严重，而对淡水龙虾病毒的感染最轻。这个实验结果表明：不同地区的
WSSV病毒对实验对象的致病性略有不同，不同品种的对虾及同一种对虾在其生长的不同阶
段对病毒的易感性也有所不同。
［关键词］白斑综合病病毒（WSSV）；对虾；地理隔离株；易感性
１ 介绍
白斑综合病病毒发现于1992年，它在Hemisphere东部对虾养殖中发病，造成了有史以来最惨重的损
失。在亚洲国家，自然感染上这种病毒的对虾种有草虾、中国对虾、长毛对虾和日本对虾。这些被感染的对虾在甲壳的内表面出现白斑点，症状出现后，对虾的死亡率高达100%。在北美，从1995年起，在德克萨斯州及南卡来罗纳州的虾场和野生虾中每年都发现WSSV。这两个州都有爆发WSSV导致对虾严重死亡的记录。1995年12月，专家对华盛顿特区美国国家动物园中发病的淡水龙螯虾进行调查，组织病理分析和电子显微镜显示其病原体与对虾的WSSV非常相象。经过基因测试、聚合酶链反应（PCR）方法和生物鉴定证实，该淡水龙螯虾的隔离种病毒确属WSSV品系，除了淡水龙虾，WSSV的寄主还包括：Metapenaeuensis, Farfantepenaeus aztecus,Fa. duorarum, Fe. merquiensis, P. semisulcatus, L. styirostris, L. vannamei（南美白对虾）, Trachypenaeus curvirostris，Exopalaemon orientalis, Macrobrachium rosenbergii（罗氏沼虾）和Procambarus charkii（一种龙螯虾）。所有的这些品种都在自然或实验条件下表现出对WSSV病毒具有极高的易感性。我们利用PCR、种间杂交以及单克隆抗体分析，在野生蟹（Calappa lophos, Portunus sanguinolentus, Charybdis sp. ,Helice tridens）、野生龙虾（Panulirus sp.）、长臂对虾体也发现了WSSV。
autoview进行这个研究的目的是对六种WSSV地理隔离株的特性和病原性状进行比较，并且调查两种典型的美国对虾对这些WSSV的易感性。
２ 材料和方法
２．１实验对虾
本实验用的对虾为无特定病原（Speciric Pathogen Free 简称SPF）南美白对虾幼虾，由俄亥俄州海洋研究所的育种室培养。这些SPF白对虾来自该研究所繁育的Kona品系，1989年从墨西哥引进。本实验使用的这批虾代号为UAZ10-97，而Fa.duorarum（杜拉对虾），取自Arizona大学Tucson水产养殖病理中心Harbor分中心孵化野生卵养成的后期幼体。这批Fa.duorarum对虾代号为UAZ22-96。
２．２病毒
本实验所采用的白斑综合病病毒WSSV分别来自中国、印度、泰国、南卡来罗纳州、德克萨斯州及华盛顿国家动物园（见表1）。为了增强致病效应，对SPF（无特定病原）的南美白对虾进行喂食或注射病毒进行接种。对一部份垂死的对虾取样进行WSSV感染的组织病理测定。剩余的垂死对虾被收集以-70℃低温冷藏以供研究（见表2）。
表１ 实验中采用的ＷＳＳＶ地理隔离株原产地分布
地理隔离种识别标号收集地点寄生品种虾龄野生或养殖收集时间中国WSSV UAX95-116A 中国山东Tenneropenae us chinensis 成虾养殖1995.5 印度WSSV UAX95-314 印度don 成虾养殖95.8.28 泰国WSSV UAX95-38A 泰国p. monodon 成虾养殖95.2.27 德克萨斯州WSSV UAX97-85 德州墨西哥湾L.setiferus 成虾野生97.5.13 南卡来罗纳州WSSV UAX97-5 Blurrton,SC L.setiferus 成虾越冬设施驯养-野生97.1.8 淡水龙螯虾WSSV UAX96-52 华盛顿DC国家动
物园Orconectes Punctimanus 次成虾驯养-野生96.3.8
表２ 本课题研究中采用的ＷＳＳＶ为Ａｒｉｚｏｎａ大学接种繁殖
地理隔离种接种识别号寄生品种寄生平均规格(g) 寄生识别号病毒源识别号接种时间接种方法组织发现中国WSSV UAZ97-54 L.Vann-amei 8 UAX 17-96 UAX95-116A 1997.4 1.M*.注射G4WSSV 印度WSSV UAZ97-56 L.Vann-amei 8.6 UAX17-96 UAX95-314 1997.4 喂食G4WSSV 泰国WSSV UAZ97-86 L.Vann-amei 4 UAX-27-96 UAX97-38A 1997.5 1.M*.注射G4WSSV 德克萨斯州
图兰朵剧本
UAZ97-106 L.Vann-amei 4 UAX27-96 UAX97-85 1997.6 喂食G4WSSV WSSV
南卡来罗纳
UAZ97-64 L.Vann-amei 11 UAX04-96 UAX97-5 1997.4 1.M*.注射G4WSSV WSSVWSSV
零下八度电影淡水龙螯虾
UAZ96-211 L.Vann-amei 10 UAX13-95 UAX96-52 1996.11 喂食G4WSSV WSSV
注：*I.M.-肌内注射。
*垂死对虾样品的常规HE染组织发现。病痕等级分为G0-G4级，G0表示检测无病灶，G4表示严重的WSSV病灶多处扩散。
金瓶梅鉴赏辞典
２．３免疫性研究
本课题对WSSV的研究实验参照Hasson et al(1995)的方法。在实验开始时，对六组来自中国、印度、泰国、德克萨斯州、南卡来罗纳州和国家动物园的WSSV接种到700尾平均体重为0.05克的PL30无特定病原南美白对虾幼虾中，这些幼虾被放养在7个容积为40L的水族箱中（每箱100尾）。六箱为实验组，一箱对照组。每个水族箱单独配置活性牡蛎壳生物滤器进行水循环。每个水箱单独用一个塑料片盖上以防止产生雾气。对照组单独放在另一个房间以免传染。实验第一天对每个实验组（一种WSSV一个水箱）喂食2次感染碎组织（按10%体重量喂食）。所有的实验组和对照组每天喂食两次adlib Rangen No.2(Buhl,1D)颗粒饲料，所有的喂食均在8：00和16：00。每天在7：00，11：00，15：00及20：00对实验对象进行WSSV感染的临床症状及死亡率进行观察。取出死亡及垂死的对虾并作统计。为了考证感染状况，从每组取出的垂死对虾均被保存起来用Davidson's AFA固定液固定并采用常规切片进行组织观察。对存活的对虾和对照组对虾也取样进行组织检查。每天对水族箱进行监测，控制箱内的亚硝酸盐和氨浓度使其不超过0.1和0.25mg/l，水温调整在26±2℃，盐度设置在26‰。
在第二个实验中，采用来自泰国、德克萨斯州、南卡来罗纳州和美国国家动物园的WSSV病毒对75尾杜拉对虾和15尾无特定病原的南美白对虾进行免疫实验，这些对虾放养在六个90升的水簇箱内，每箱15只对虾，其中4箱作为实验组，第五箱为对照组，第六箱为模式组接种泰国WSSV病毒。在第1天对每实验组喂食一次WSSV感染碎片（一箱一种WSSV地理隔离株），按5%的体重量喂食。对照组和实验组每天喂食两次ad-lib35%Rangen颗粒饲料。本实验采用的生物鉴定法和南美白对虾相同。
２．４组织过程
样品按照标准程序进行处理，采用Davidson's AFA 固定液常规组织处理法固定组织，并用苏木精和伊红染料HE染。对普通对虾和被WSSV病毒感染的对虾进行解剖，按照Bell和Lightner(1998)及Lightner（1996）的命名法对其进行组织和病理命名，伤害定级按照Lightner （1996）的定级标准。
３ 结果
南美白对虾幼体对接种的六组WSSV病毒高度易感。感染病毒后14天内死亡率达100%。杜拉对虾稚虾对WSSV的抵抗力稍强，经过18天的免疫实验，其死亡率为35%-60%，同时对不同种的WSSV死亡率略有不同。
经过组织病理分析，我们证实这些对虾都是因感染WSSV病毒致死。其病变典型且严重（达4级），在
病虾细胞表皮、附肢、呼吸器官、体表、前肠、后肠管、结缔组织、排泄腺、淋巴组织、造血组织及其它类型细胞内均发现有明显的病毒包涵体。对照组中的南美白对虾和杜拉对虾在组织病理检查中显示正常。我们发现被病毒感染后存活的杜拉对虾的组织发生了重大的变化，与南美白对虾相比，其通常最易受到WSSV侵袭的组织（如角质层上皮及与之相连的组织）显示相对正常，仅仅有一部份细胞出现WSSV包涵体。含有病毒包涵体的细胞出现炎症反应特征的血瘤结构。存活的杜拉对虾的淋巴结出现水肿，与淋巴器官相连的组织上发现大量的液泡。大量的球形细胞，推测已转移到淋巴结，出现在与肝胰腺荚膜相连的组织上。在排泄腺中，血瘤在腔和细管壁中形成。有时候，这些细胞融合形成多核的巨型细胞。有趣的是，存活的杜拉对虾的胃动脉、生殖腺和造血组织的WSSV感染最为严重。在与生殖腺相连组织细胞和胃动脉的鞘细胞里发现WSSV的包涵体。在造血组织中出现多种固缩核。
４ 讨论
我们对两种美国对虾的两个阶段，即南美白对虾幼虾、稚虾和杜拉对虾稚虾进行六种WSSV 地理隔离株的易感性实验。实验表明，南美白对虾幼虾和稚虾对六组WSSV具有很高的易感性，在14天内累计死亡率达100%。相比之下，杜拉对虾对WSSV病毒显示出一定的抵抗力。实验进行18天时间，实验结束后其存活率为35~60%。这些实验证实了（Lightner et al.,1998）的研究结果：即杜拉对虾稚虾对中国的WSSV病毒具有一定的抵抗力，但南美白对虾稚虾则不然。然而，在一个初步的研究实验中，我们采用同一批的杜拉对虾幼虾，接种中国的WSSV病毒，其死亡率为100%（数据未公开）。由此可
东营孟兆军见，杜拉对虾稚虾对WSSV的抵抗力比幼虾（PLS）强得多。而南美白对虾幼虾（Lightner et al.,1998）和稚虾则显示出对WSSV很弱的抵抗能力。
来自德克萨斯州的WSSV致病力比其它地方的WSSV强得多，而淡水龙螯虾的WSSV致病力最弱。虽然我们在对南美白对虾的研究中并未发现两者在死亡率上存在明显的差异，但德克萨斯州的WSSV引起的死亡率比其它地方的WSSV快得多，而淡水龙螯虾的WSSV最慢。在对杜拉对虾的研究中，不同地区的WSSV之间表现的差异则更加明显。德克萨斯州的WSSV引起死亡率更高且比其它地方的WSSV更早发病。相比之下，淡水龙螯虾的WSSV对杜拉对虾致病率最弱，引起的死亡率最低，发病时间也比其它隔离株迟。
我们把所有的垂死对虾样品都收集起来进行组织病理分析，结果证实为WSSV感染。在存活的杜拉对虾中观察到血瘤以及因感染产生吞噬作用的痕迹和坏死的细胞。表明这些对虾由于受到刺激而产生了免疫反应。受到WSSV损害较严重的淋巴器官，胃动脉、造血组织显示吞噬作用是对虾免疫反应的重要方式。在存活的杜拉对虾生殖腺内观察到的WSSV包含体，说明其存在垂直感染的可能性。
因为缺少对虾细胞株对WSSV进行细胞培养，所以难以对大量的对虾病毒进行精确的统计。在本实验过程中，接受免疫试验接种的每个实验组都喂食相同体重百分比的感染组织。病毒的剂量是通过组织观察、分级、点着鉴定以及DNA和蛋白质观察仪进行测量（数据未公开）。但由于受到虾组织的寿
命期、生物特性、（对虾）个体的大小、病毒在组织中的分布等因素的限制，接种实验中的病毒聚集量很可能存在差异。然而，由于WSSV复制迅速且为一种极其致命的虾病原体，实验中所测出的不同的死亡率应该是由于遗传的差异而非剂量的差异。我们通过RFLP鉴定测试出不同种的WSSV存在着遗传差异也证实了这种可能性。
总结以上实验，这个研究结果表明，六种WSSV地理株对南美白对虾具有极高的致病力，而杜拉对虾稚虾则显示出对WSSV感染有一定的抵抗力。实验证明，不同的WSSV地理株的致病性略有不同，其中德克萨斯州的WSSV致病力最强，而淡水龙螯虾最弱。以后的研究将致力于遗传标记的研究以便对不同的WSSV地理株加以区别，以及对致病性的差异进行标记。
（福建省淡水水产研究所，李惠榕译自《Aquaculture Jan. 1999》）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议