目 的 要 求
1． 学习核酸的提取原理和肝组织中核酸的提取方法。
原 理
参考实验教材257页和260页“原理”部分。
在生物体内RNA和DNA通常与蛋白质结合成RNA核蛋白和DNA核蛋白的形式存在，并且分别主要存在于细胞质和细胞核中。因此，分离提取核酸首先要将细胞破碎制成匀浆，使核酸处于容易提取的状态；再根据RNA核蛋白和DNA核蛋白在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度不同进行分离，（RNA核蛋白溶于0.14mol/L NaCl溶液中，而DNA核蛋白则溶于1.0mol/L NaCl溶液中，在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度很低）。此外，蛋白质的存在可干扰核酸的测定，必须除去蛋白质。将氯仿icu病房设计
—异戊醇蛋白质变性沉淀剂加入RNA核蛋白和DNA核蛋白溶液中，离心 后溶液分为三层，下层为氯仿，中层为变性蛋白质凝胶，上层是含有核酸的水溶液。再利用核酸不溶于乙醇等有机溶剂的性质使核酸沉淀析出。
试 剂 和 器 材
一、 试剂
1．氯仿—异戊醇（20：1 v/v）
2．95%乙醇
二、 器材
组织捣碎机、离心机、研钵或玻璃匀浆器，微量核酸定量仪。
用到的器皿需要灭菌
操 作 方 法
1． 肝匀浆的制备
取新鲜猪肝，用冷的生理盐水洗去肝脏表面的血液，用滤纸吸干水分，立即剪成碎片，称取20g放入组织捣碎机中，加入预冷的0.14mol/L NaCl溶液约50ml，置高速组织捣碎机内间断破碎约2分钟，再加0.14mol/L NaCl溶液至总体积为80 ml，即制成肝匀浆。
2． RNA核蛋白与DNA核蛋白的分离（王潮歌老公DNA必须提取，RNA为选做项目）
取肝匀浆4 ml（相当于1g肝组织），放入离心管（或小试管）中，以3000转/分离心20分钟，将上层RNA核蛋白提取液吸出放入另一离心管（或小试管）中，留待进一步提取；下层为含有DNA核蛋白的沉淀（估计体积为1 ml），用二倍体积的1.5 mol/L NaCl溶液将DNA核蛋白沉淀物转移至研钵（或玻璃匀浆器），仔细研磨数分钟，使奥鸟DNA核蛋白成匀浆混合液，倒入离心管（或小试管）中。
3． 去除蛋白质，沉淀RNA
于RNA核蛋白提取液中加入等体积氯仿—异戊醇混合液，用玻璃纸堵住管口，振摇10分钟，以3000转/分离心15分钟，此时溶液分为三层，吸出上清液置离心管（或小试管）中，加二倍体积冰的95%乙醇，轻轻搅拌，可见有RNA沉淀析出，以3000转/分离心15分钟，弃去上层乙醇，沉淀即为RNA粗品。
于RNA沉淀物中加入4 ml 0.14mol/L NaCl溶液使之溶解，若浑浊可离心5~10分钟，上清液作RNA纯度和含量的测定。
4． 去除蛋白质，沉淀DNA
将DNA核蛋白匀浆混合液以3000转/分离心20置换贴图分钟，取出上层DNA核蛋白提取液，加入等体积氯仿—异戊醇混合液，用玻璃纸堵住管口，振摇10分钟，以3000转/分离心15分钟，此时溶液分为三层，吸出上清液置离心管（或小试管）中，加二倍体积冰的95%乙醇，用玻璃棒轻轻搅拌，可见有白纤维状的DNA缠绕在玻璃棒上（或为乳白絮状沉淀），以3000转/分离心15分钟，弃去上层乙醇，沉淀即为DNA粗品。
于DNA沉淀物中加入2 ml 1mol/L NaCl溶液使之溶解，若浑浊可离心5~10分钟，上清液作DNA纯度和含量的测定。
5．提取液适量稀释后分别，鉴定核酸的纯度及计算核酸含量。
注 意 事 项
1． 操作中注意被提取物存在于上清液或沉淀中，保留所需要的部分进行后
续步骤。
2．离心机的使用，同步离心。
3．实验步骤以流程图表示。
4．分析结果，提出改进方法。
试剂
1．0.14mol/L NaCl溶液：4.095g NaCl溶于500ml纯水中并灭菌；
2．1 .0mol/L NaCl溶液：29.25g NaCl溶于500ml纯水中并灭菌；
3．1.5 mol/L NaCl溶液：43.875g NaCl溶于500ml纯水中并灭菌；
仪器
名称 | 名称 | 每组所需/个 | 组数 | 总共 |
1 | 组织掏碎机 | | | 1 |
2 | 离心机 | | 赵茂辰 | 2 |
3 | 玻璃匀浆机 | 1 | 8 | 8 |
5 | 微量分光光度计 | | | |
高鸿宾6 | 头 | | | 若干 |
7 | 离心管 | 10 | 8 | 80 |
8 | 头 | | | 若干 |
9 | 移液 | 1 | 8 | 8 |
10 | 滤纸 | | | 若干 |
11 | 剪刀 | | | 若干 |
| | | | |
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