一、原理
采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、方法
1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ
g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收
集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0），振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L
NaOH,0.5%SDS），震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC，震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染
体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min，离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。唐斯
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min，离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
卫生部副部长
13．37℃水浴30min。
14．样品放一20℃冰箱保存备用。
三、试剂
1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)
配制方法：
Tris 1.211g
EDTA.Na 0.037g
用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)
配制方法：
NaOH O.4 g
SDS 0.5 g
加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.
3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)
配制方法：醋酸钠 24.6g
用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2，加重蒸水定容至100ml。
纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红或黄结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。
5．无水乙醇
置-20℃冰箱中保存备用
6．70％乙醇
置-20℃冰箱中保存备用
高温超导电机
7．核糖核酸酶(10mg／ml)
配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。
四、材料
1．菌种：
大肠杆菌(pUC57)
2．培养基
LB液体培养基
精解蛋白胨 3g
酵母浸出粉 1.5g
氯化钠 3 g
葡萄糖 0.6g
按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH 调
pH至7．2～7．4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min.
l抗菌素：
氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。
五、仪器：
恒温振荡器。
低温冰箱-20℃
真空泵。
台式高速离心机
六、说明
1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐
等。
2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子
的干扰作用；作中的EDTA是二价离子
Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅
助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。
3、TENS中NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3 时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而
使染体DNA与质粒DNA变性。
TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合
成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核
糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用
Rnase去除RNA时)受干扰。
4、3．0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA
能够复性，并能稳定存在。染体DNA不能复性(染体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构) 而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。pH5．2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与
SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
5．饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。水是极性分子。当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失，(2)酚很容易氧化，变成粉红，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris —HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。饱和酚中加上8一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜．溶解在酚中后，使酚带上
颜，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。
6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：合胞病毒
用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉
鲸教学设计淀剂。
乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀，一般实验中，用2倍体积
的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的最终含量占67％左右。由此可预见，也可用95％乙醇
沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因而
DNA损失也增大，影响收率。
乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度O.1一O.25mol／l在pH 8左右的DNA 溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时。只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不
完全。但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。
乙醇沉淀DNA．一般采用低温条件，这是由于在低温条件下．分子运动大大减少，DNA 易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀，一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。大量提取DNA时，目前习惯上常采用如下几种方法：
保存在家用冰箱结冰盒内过夜
保存在-2℃亡冰箱内过夜
保存在-70℃冰箱内 30mm～2h
放置干冰中（约-20℃） 30min
qyg放置干冰加酒精中(约-70℃) 16mm
放置在液氮缸中液氮的气相内，不可以浸在液氮中(温度在-198℃左右)5～15min。
除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇，最终除区其残留部分的难度更大。此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时，更易发生，所以一
般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。
7．影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。
(1)菌株
质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。一般最好选用enA基因突变的宿主菌，即enA-菌株，如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。
enA基因是核酸内切酶I。核酸内切酶I是一种12kDa的壁膜蛋白，受镁离子激活，可被EDTA抑制，对热敏感。双链DNA是核酸内切酶I的底物，但RNA是该酶的竞争性抑制剂．能改变酶的特异性，使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性，变为平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸内切酶I的功能仍不清楚，enA基因突变的菌株没有明显的表现改变，但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长期核酸内切酶I 的
表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶I水平高300倍。此外，培养基中促进快速生长的成
分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶I水平增高。
此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1—Blue生长速度较慢。,HBl01及其衍生菌株如TG1及JMl00序列，含大量的糖，这些糖如果在质粒纯化过程中不除去，在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活性。
(2)质粒的拷贝数
细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点(replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进一些特殊的载体时，能降低质粒的拷贝
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