核酸抽提中裂解液的作用及选择

醋酸钠核酸抽提中裂解液的作用及选择
核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。下面主要讲述裂解液的作用及选择。
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经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶;利用蛋白酶(蛋白酶K)将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂裂解的,该方法已经成为了 RNA 抽提的主流,却不是基因组 DNA 抽提的主流。章国锡
培训经理认证含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的裂解作用是使蛋白质变小,故而对蛋白质的游
离有巨大的促进作用;同时,巨大的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的,蛋白质被蛋白酶消化变小后,则不容易被基因组 DNA “缠”住,有利于蛋白质在纯化操作中的去除,使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。
当得率和纯度要求不是最高,考虑经济性及操作步骤简单时,可以考虑不含蛋白酶的裂解方法。关键是控制好裂解液/样品的比例。该方法结合高盐沉淀,可以实现最简单的操作。
高浓度蛋白质变性剂 (如 盐酸胍、重金属盐等) 的裂解方法,是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶,从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 (主要是植物),其它绝大部分样品的 RNA 的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提,特点是快速简单,纯度较低。
SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。关键是控制好裂解液/菌体的比例和操作温和。蛋白质的沉淀效率在 4°C 会更好,采用 4°C 离心去蛋白质,可以提高质量。RNA 的去除可以靠在溶液中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。
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PCR 模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR,非常快速。也正因为不纯化,所以,假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水,复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应,而且能提高裂解效率,甚至还可能部分消除样品内抑制
PCR 反应杂质的东西,如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单,多使用温度的变化来实现样品的裂解,如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中出阳性样品,但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。
以人为本的管理理念核酸抽提不同的方法,需要的裂解液也不同,其裂解液的选择也是多种多样的,用于核酸抽提的生化试剂产品中相关裂解作用的产品有蛋白酶K、SDS、 RNase A 、盐酸胍、Triton X-100、甲酰胺、Chelex 100 等

本文发布于:2024-09-22 04:18:57,感谢您对本站的认可!

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