实验11 动物肝脏中DAN的提取及含量测定
一、原理：
核酸是构成生物体最主要的组成成份之一，是遗传信息的载体；和蛋白质的生物合成密切有关。核酸在生物的遗传变异，生长繁殖及分化发育等方面都起着决定性的作用。核酸的研究对于肿瘤的发生和也有重要意义。核酸的提取是研究核酸的结构，功能和理化性质的前提。提取核酸的方法较多，目的不同可采用不同的方法，如为了得到高聚程度的具有生物活性的核酸可用SDS（十二烷基硫酸钠）法，酚法或氯仿—异戊醇法除去蛋白质。如制品有些变性，降解也不成问题，可用浓盐法。 本实验利用在浓盐（1—2M NaCI）中，脱氧核糖核蛋白（DNA）的溶解度很大，核糖核蛋白（RNA）的溶解度很小，而在稀盐（0.14M NaCI）中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白溶解度很大，因此可用不同浓度的氯化钠溶液，使两者分离。同时利用SDS使DAN与蛋白质分开，利用氯仿—异戊醇法除去蛋白质，使DNA溶于浓盐溶液中。再用高浓度的乙醇使DNA纤维析出。
所得DNA为粗制品。确定其含量及纯度可应用紫外吸收法及其他化学方法。本实验拟用“二胺法”对产品进行鉴定。
DNA经酸解生成嘧啶、嘌呤、磷酸及脱氧核糖，脱氧核糖在酸性条件下脱水生成W一羟基一γ一酮基戊醛。后者与二苯胺作用显示蓝，在660nm有最大吸收值。待测样品DNA浓度在50—500ug/ml ，光密度读数与DNA浓度有线性关系。样品中含有少量RNA对测定影响不大，盐类对测定有影响，蛋白质、多糖类及其衍生物、芳香醛，羟基醛也与二苯胺作用呈，干扰测定。
反应式：
CHO CHO
H C H CH2 NH
H+
H C OH CH2 兰物质
－H民国时期学生装2O
H C OH C==O
CH2OH CH2OH
脱氧核糖 W—羟基—γ—酮基戊醛
二、试剂：
1、0.14M NaCI—0.15M EDTA—Na溶液。
2、25% SDS溶液（十二烷基硫酸钠）用40%乙醇配。
3、5M NaCI溶液。
4、氯仿—异戊醇混合液：氯仿：异戊醇==24：1（V/V）。
5、0.1SSC液：0.015M NaCI—0.0015M柠檬酸三钠溶液，称取氯化钠0.828g及柠檬酸三钠0.341溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
6、70%、80%、95%乙醇及无水乙醇。
7、二苯胺试剂：（市售二苯胺试剂不纯，需用75%乙醇纯结晶1～2次）。将1g 二苯胺溶于98ml 冰醋酸中，加2ml 36N硫酸，冰箱保存，当天有效。
8、标准DNA：500ug/ml。
气浮垫三、操作
1、将一只大白鼠迅速处死，取出肝脏，在冻冰上去脂肪，结缔组织等、用冰箱予冷的0.14 M NaCI—0.15M EDTA—Na溶液漂净血液，置－20思想政治工作研究℃低温冰箱或普通冰箱冰盒内冷冻。
逆向建模
2、取出冻肝，待溶化后，称取3 g，剪成碎块，加入15 ml 0.14 M NaCI—0.15M EDTA—Na溶液，在玻璃匀浆器中充分匀浆，破碎细胞，将肝匀浆倒入予冷的离心管中以3500转/min离心20分钟，弃去上清液（含RNP），沉淀物（大多为含DNP的细胞核），再加适量上述溶液，搅匀，离心，重复二、三次。
3、取出沉淀物于小烧杯中，加入10ml 0.14M NaCI—0.15M EDTA—Na溶液，再滴加1ml 25%的SDS，边滴加边搅拌10分钟，SDS有破碎核膜，质膜及抑制DNASe的作用。
4、加入5M NaCI溶液，使终浓度为1M，继续搅拌10分钟，然后加入一倍体积的氯仿一异戊醇混合液，于带磨口塞的锥型瓶中振摆20分钟，3500转/分，离心20分钟，分为三层，上层水相，中层为蛋白质，下层为有机相。小心用皮头滴管吸取上层水相于小烧杯中。加入一倍体积的95%的乙醇，边加边搅，DNA丝状物即缠绕在玻璃棒上。
5、用70%乙醇洗DNA丝状物两次，再用95%乙醇洗一次，挤干。再溶在0.1SSC液中，用氯仿一异戊醇（据4）重复去蛋白数次，到中层蛋白质极少为止。上层水相再用95%乙醇沉淀出DNA，用玻璃棒搅出白 DNA纤维，依次在70%、80%、95%以至无水乙醇中浸洗去盐。
6、从玻璃棒上刮下丝状DNA粗品，立即置于称量瓶中在五氧化二磷干燥器中真空干燥二小时，分析天平称量所得DNA粗品，计算每克肝脏DNA粗品的得率。 机甲战士3
7、浓度检定。
标准曲线的制作，取与被测样品相同来源的DNA纯化制品，用定磷法测定纯度，用蒸馏水按纯DNA含量配成500ug/ml溶液。吸取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml于六支试管中，补水到1.0ml，再加二苯胺试剂，置沸水浴10分钟后，取出后用冷却后，测OD660为纵坐标，纯DNA量（ug）为横坐标，画出标准曲线。 另取所制得DNA粗品10mg溶于3ml蒸馏水中，混匀，取1ml加2.5ml二苯胺试剂，操作同上。（样品浓度可根据显后与标准曲线比较自行适当调整，使DNA的浓度在100～400ug/ml以内）。从标准曲线查出DNA含量，再根据稀释倍数计算出样品中DNA的含量。测定与标准曲线用同一批试剂，同一台仪器。纯度计算公式：
标准曲线上查得数据（ug/ml）
纯度== ×100%
样品浓度×1000（mg/ml）
台标实验注意：
为防止DNA的解聚和降解，实验须在低温条件下进行，操作温和，避免剧烈的搅拌，应避免二价金属离子对DNA的活化。
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