核酸检测及相关技术.ppt
1、核酸检测及相关技术根本技术：核酸提取〔DNA/RNA〕、鉴定、 PCR(RT-PCR/REAL-TIMEPCR)、琼脂糖电泳相关技术：基因克隆、转化；SSCP、RELF、杂交〔southern/northern、原位杂交〕、芯片检测内容一、根本技术〔一〕核酸提取1.基因组DNA提取2.非基因组DNA提取3.RNA提取〔二〕PCR扩增1.一般PCR2.荧光定量PCR(三)核酸、PCR产物的鉴定1.琼脂糖凝胶电泳2.紫外分光光度法二、相关技术三、分子平台使用流程及仪器设备操作标准〔一〕核酸提取提取DNA目的 2、：主要是对基因和基因组进展分析。提取RNA目的：主要是对基因表达进展分析。基因组DNA提取根本步骤材料预备裂开、裂解细胞核酸分别和纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中组织培育的细胞细菌外周血〔一〕基因组DNA提取组织－－匀浆或液氮研磨培育细胞－－蛋白酶K外周血--裂解液细菌--裂解仿或吸附柱异丙醇、吸附柱70％的乙醇洗涤蛋白质的去除盐离子的去除1、材料预备基因组DNA来源：组织/培育的细胞/外周血最好使用新颖样本，低温保存的样品不要反复冻融提取外周血DNA时，要选择有核细胞〔单个 3、核细胞〕培育的细胞培育时间不能过长，否那么会造成核酸降解含病毒的标本DNA含量较少，提取前先富集〔一〕基因组DNA提取取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE缓冲液0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
驱动蛋白将匀浆液转移到1.5ml离心管中。加20%SDS25μl，蛋白酶K(2mg/ml)25μl，混匀。60℃水浴1-3h。蛋白酶K 使多种蛋白质水解，并且蛋白酶K可在SDS存在下有活性。a匀浆法TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有爱护作用，不易破坏其完好性或产生开环及断裂。SDS能使DNA和蛋白质分开。b液氮研磨法组
4、织标本的处理：〔一〕基因组DNA提取2、裂开裂解细胞液氮研磨组织留意事项确定起始样品量，在研磨前称量好。研磨过程中要准时添加液氮，边研磨边添加。可以将研钵放在大小适宜的泡沫盒里面研磨，这样可以保温，减小液氮挥发的速度。研磨成粉末，在液氮挥发尽，应马上参与裂解溶液〔裂解溶液确定要含有抗氧化剂，防止DNA被氧化降解。常用的抗氧化剂有PVP，β-巯基乙醇等〕。裂解液参与后连续研磨，直至标本溶化成液态。b液氮研磨法培育细胞处理：将培育细胞悬浮后，用PBS洗涤一次。离心4000g，5min，去除上清液。加10倍lkj
5、体积的裂解缓冲液。50-55℃水浴1-2h。要散细吹胞团块，使细胞被充分裂〔一〕基因组DNA提取裂开裂解细胞外周血的处理红细胞裂解法将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，参与1ml磷酸缓冲盐溶液〔PBS〕，混匀，3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA
提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。〔一〕基因组DNA提取裂开裂解细胞分别单个核细胞Ficoll-hypaque〔葡聚糖－泛影葡胺〕密度梯度离心法，由于血液中各有形成分的比重存在差异，因
6、此得以分别。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll 而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板那么因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分别单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其上下与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。细菌的处理将菌株接种于液体LB培育基，37℃震荡培育过夜。取1.5ml培育物12000rpm离心2min。沉淀中参与500μl的TE缓冲液
7、，反复吹打使之重新悬浮，参与30μl10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。〔一〕基因组DNA提取裂开裂解细胞核酸分别、沉淀、洗涤和溶解暴露出的DNA〔一〕基因组DNA提取吸附材料或氯仿抽提吸附柱或异丙醇沉淀漂洗液或70%乙醇洗涤TE缓冲液或双蒸水水溶解分别洗涤沉淀溶解质粒DNA的提取细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体，提取后可用作构建基因表达载体。 〔二〕非基因组DNA提取培育细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分别和纯化质粒DNA分别质粒的三大步骤材料预备使用途于对数期的新颖菌体〔老化菌
8、体导致开环质粒增加〕培育时应参与筛选压力，否那么菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，那么应加大菌体用量菌株不要频繁转接〔质粒丢失〕质粒DNA提取〔二〕非基因组DNA提取当用碱处理DNA溶液时，变性染体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合
形成沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其自然构象；超螺旋质粒DNA 分子那么以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将其分开质粒DNA提取〔二〕非基因组DNA提取裂解法原理：裂解细菌质粒DNA碱裂解法流程对数期菌体溶液III中和溶液
9、I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀枯燥溶解酒精沉淀质粒DNA溶液质粒DNA提取〔二〕非基因组DNA提取溶液1作用是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，抑制DNase的活性，螯合二价金属离子。溶液2：溶液2中的NaOH是最正确的溶解细胞的试剂，破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液3：是为了中和NaOH，由于长时间的碱性条件会打断DNA，碱处理的时间要短，而且不得猛烈振荡，不然最终得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入酚/氯仿/异戊醇进展抽提，然后进展酒精沉淀才能得 10、到质量稳定的质粒DNA，暴露出的DNA吸附材料或氯仿抽提吸附柱或异丙醇沉淀漂洗液或70%乙醇洗涤TE缓冲液或去离子水溶解质粒DNA纯化质粒DNA 提取〔二〕非基因组DNA提取核酸纯化时所需试剂蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性〔SDS、异硫氰酸胍等〕高盐洗涤蛋白酶处理盐离子的去除：70％的乙醇洗涤DNA提取常见问题DNA样品不纯DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反响DNA中残留有金属离子缘由对策重新纯化DNA，去除蛋白等杂质〔具体方法见前〕重新沉淀DNA
11、，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数〔2-3次〕〔一〕DNA提取及鉴定DNA提取常见问题DNA降解缘由材料不新颖或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过。省略局部。选阳性细胞克
隆SSCP、RFLPSSCP：单链构象多态性，是一种基于DNA构象差异来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，假设碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。RFLP：限制性片段长度多态性〔restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP〕用于检测DNA 序列多态性。先将
12、待测的靶DNA片段进展复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进展酶切，最终经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。三、分子平台使用流程及标准〔一〕分子平台试验区域〔二〕仪器的使用标准〔一)分子平台试验区域试验室分为三个区；RNA提取专用区，DNA提取室，PCR扩增及PCR产物分析区严格遵守各区域专用，制止混用进入PCR扩增及PCR产物分析区，带进去的东西一律不准带出。不做分子试验的同学制止进入分子试验室。为了大家共同利益请疼惜试验室的设备以及环境1、标本制备、RNA提取室用处：RNA专用提取室 13、仪器：生物平安柜和低温高速离心机留意事项：使用前进展预约登记严
调查表作文格依据各仪器设备使用标准进展操作使用后准时做好清洁工作。2、标本制备、DNA提取室用处：DNA提取、组织研磨以及核酸紫外检测仪器：生物平安柜、超净工作台、低温高速离心机、PCR仪器〔做逆转录用〕和超微量紫外分光光度计留意事项：严格依据各仪器设备使用标准进展操作请疼惜仪器设施，使用后准时做好清洁工作。3、PCR反响及产物分析区使用留意事项用处：为PCR反响及PCR 产物分析专用区仪器：水平制胶槽、微波炉、水平电泳仪、PCR仪和凝胶成相系统留意事
王孟英
14、项：严格依据指定区域进展特定操作，切忌混用以免造成污染勿将PCR 产物、凝胶、本室的一切物品和设备带出本室试验室垃圾的处理提取室的头等一次性物品确定要用塑料袋包好后扔到各试验区域指定的位置。PCR产物分析室的点样头、凝胶确定要包好后扔到指定区域。〔二〕仪器的使用标准使用前生疏仪器设备的使用方法和留意事项使用时进展登记温存操作使用后留意关闭电
源做好清洁工作使用方法：检查电源电压是否匹配后，接通电源。生物平安柜工作前必需预先翻开风机。生物平安柜工作时先关闭紫外灯，工作时不要将移门移过平安线的高度。留意事
15、项：工作台面禁放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。制止在工作台面上记录书写，工作时尽量避开作明显扰动气流的动作；制止在预过滤进风口部位放置物品，以免拦住进风口造成进风量削减，降低净化力量。生物平安柜使用后即刻以5%施康消毒液洗擦工作台面，再以75%酒精擦一次；紫外灯消毒30分钟后关机。使用后做好登记将垃圾包好扔到指定的位置生物平安柜内的加样器只能在该柜内使用生物平安柜使用操作流程加样器使用留意事项使
用前留意加样器的使用方法留意调整的方向。制止调整超过最大量程轻拿轻放，留意加样器的清洁。什么
16、地方的加样器只在该位置使用离心机使用标准离心前先将待离心物品的管壁擦洁净，必需配平先盖好离心机内盖再盖外盖，离心后将离心机外盖翻开用水池上面的抹布将离心机擦拭洁净，白天不用
关电源晚上最终一个使用者关闭电源低温离心后确定将盖子翻开，晾干水汽掌上离心机使用标准用处：试剂、样品等短暂离心留意事项：配平、清洁和仅在指定区域内使用PCR扩增仪使用标准使用期进展预约登记，使用后登记仪器运行状态。操作时按键要温存使用后准时告知下一位预约者严格区分做逆转录试验和PCR试验的PCR仪。PCR产物不要带出PCR扩增区，电
17、泳完用塑料袋包好后扔到指定位置。如需暂存请保存在PCR扩增区的冰箱内，严禁带出。做逆转录时PCR仪使用标准地点：DNA提取室留意事项：此PCR 仪为逆转录专用。确定不能用于PCR试验使用前预约登记，使用后关闭电源PCR 扩增产物暂存处使用标准第一次使用前来夏妍处进展登记产物严格存放在自己的区域产物短期存放准时进展清理水平制胶区使用标准使用前进展登记此区域内的设备与物品只可在此处使用，严禁带出访用时将排风翻开有毒物品〔EB〕使用后要准时盖好盖子头等一次性物品用一次性塑料手套包好后扔到该通风厨内的垃圾桶中P小人物大境界
18、CR产物点样区、水平电泳区使用标准使用前进展登记使用时将排风翻开PCR点样只能在此区域进展使用后的头凝胶等用一次性手套包好后扔到该通风橱内的垃圾桶中水平式电泳槽使用操作流程使用方法：凝胶从制胶槽中取出，移入电泳槽；在两水槽中参与电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没，水位应高出液面1mm.电压的上下可依据凝胶的长短进展选择，调整电压旋钮，可选择电压上下.使用完胀锚螺栓
毕后，关闭开关。留意事项：电泳时应留意观看电泳的速度，留意凝胶条带不行泳出凝胶以外。电泳槽内的缓冲液应将凝胶完全浸没。如缓冲液过少应准时添加。连接电泳仪
19、时应留意电源的正负极方向，不行连错。凝胶成像系统使用标准使用方法：开启电脑至WINDOWS处于正常工作状态；双击桌面上的GIS图标，进入软件；拍摄：①翻开拍摄界面(单击左侧数第五个图标)②把胶置于灯台上③选择透射或反射键进展拍摄(选择后单击即可)，单击拍摄键选择曝光时间拍摄，并保存图像.作完毕，关闭软件窗口；关闭电脑。留意事项：使用后，将胶块从暗箱中取出，用75%酒精棉擦拭暗箱放胶块平台。保持好平台外表的光滑，洁净。否那么会影响下一次的拍摄效果。分子试验室有毒物品EB溴化乙锭〔ethidiumbromi
20、de〕，一种高度灵敏的嵌入性荧光染剂。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。强诱变剂，吸入有极高毒性。刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。可能有不行逆后果的危急。具有高致癌性。严格在操作台内进展操作，以避开污染环境和危害人体安康。具有高致癌性!会在60-70度是蒸发所以最好不要在胶太热的时候加分子试验室有毒物品DEPC二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate)，可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进展，并避开接触皮肤。DEPC毒性并不
21、是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩分子试验室有毒物品氯仿(CHCl3)对皮肤、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用。它是一种致癌剂，可损害肝和肾。Trizol极强的裂解液，操作时不要把trizol溅到皮肤上，尤其要留意眼睛不要溅到。难闻气味，主要是由于trizol中含有苯酚，是刺激性气味。对呼吸道有损害，闻久了会有晕的感觉。全部使用试验室的人员，请在试验前做好打算。提前登
记、预约。以防止试验冲撞，影响试验。试验开场前应检查仪器是否空闲，是否能正常运转。试验进展时应当经常留意仪器有无异样状况。试验中所用
22、的试剂和废弃物，不得任凭散失、遗弃，应按规定处理，以免污染环境，影响身体安康。试验完毕后要细心洗手试验室全部的门把手、水龙头及仪器的操作面板，严禁带手套操作。试验根本要求祝大家试验顺当
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