doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2018.08.015
㊃免疫学技术与方法㊃
人CD4胞外区蛋白在杆状病毒⁃昆虫细胞系统中的表达纯化及性质鉴定① 乔佳明 张芝晴 张振勇 李少伟 夏宁邵 顾 颖 (厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门361102) 中图分类号 Q74 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2018)08⁃1201⁃05
①本文为国家自然科学基金(No.81671645)㊂
作者简介：乔佳明，男，硕士，主要从事HIV 病毒包膜蛋白方面研究,E⁃mail:381090358@qq㊂
通讯作者及指导教师：顾 颖，女，博士，副教授，主要从事HIV 病毒
学方面的研究,E⁃mail:guying@xmu.edu㊂
[摘 要] 目的：通过条件优化实现人CD4蛋白胞外区在杆状病毒⁃昆虫细胞表达系统中的高效表达，并对纯化获得的人CD4蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析㊂方法：通过选择人CD4分子胞外片段构建 重组杆状病毒(pAc⁃CD4)，然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达，采用镍离子亲和层析纯化㊂运用SDS⁃PAGE㊁Western blot㊁体积排阻谱㊁ELISA㊁SPR 法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性㊂通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB /c 小鼠，监测小鼠免疫血清的抗体生成㊂结果：经纯化可获得纯度90%以上的人CD4蛋白，每升细胞培养液最终可获得11.2mg 的目的蛋白，且该人CD4胞外区蛋白具有良好的抗原性㊂小鼠血清监测结果显示人CD4蛋白能有效刺激机体产生免疫应答，显示其具有良好的免疫原性㊂结论：本研究通过杆状病毒⁃昆虫细胞系统进行高效表达，获得抗原性和免疫原性良好的人CD4胞外区蛋白，为HIV 受体和感染的研究奠定基础㊂
[关键词] 杆状病毒⁃昆虫细胞表达系统；人CD4；免疫
Expression ,purification ,characterization of human CD4derived from baculovi⁃rus⁃infected insect cells
QIAO Jia⁃Ming ,ZHANG Zhi⁃Qing ,ZHANG Zhen⁃Yong ,LI Shao⁃Wei ,XIA Ning⁃Shao ,GU Ying .State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics ,National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Disease ,School of Public Health ,Xiamen University ,Xiamen 361102,China
[Abstract ] Objective :To establish a robust method for expression and purification of the extracellul
ar fragment of human CD4in the baculovirus⁃based insect cell expression system,by the virtue of optimization of experimental condition.To character the purified CD4protein in physiochemical property,antigenicity and immunogenicity.Methods :The gene encoding the extracellular fragment of human CD4was cloned into baculovirus vector (pAc⁃CD4)for production of recombinant baculovirus,then the CD4protein was expressed in baculovirus⁃infected insect cells.SDS⁃PAGE,Western blot,High⁃performance size⁃exclusion chromatography,ELISA,SPR were carried out to characterize physicochemical properties of CD4protein.BALB /c mice were immunized by CD4formulated with freund′s adjuvant,the immunogenicity was measured by HIV neutralization assay.Results :The CD4obtained from insect cell expression system possesses a high purity of more than 90%and appoximate yield of 11.2mg /L.The CD4protein demonstratesan excellent reactivity against anti⁃CD4antibody and a good immunogenicity in mice.Conclusion :Our study successfully established a robust method for expression and purification of the extracellular fragment of human CD4in the baculovirus⁃insect cell system and pave a way to the investigation on HIV receptor and infection.
[Key words ] Baculovirus⁃based insect cell expression system;Human CD4;Immunization
人CD4分子是一种单链跨膜蛋白，其胞外区具
有4个Ig 样的结构域，其中远端能够与主要组织相
容性复合体Ⅱ(Major histocompatibility complexclass Ⅱ,MHCⅡ)类分子结合，胞质区可以结合酪氨酸蛋白激酶p56lck ，在部分T 细胞㊁胸腺细胞㊁单核⁃巨噬
细胞㊁EB 病毒转化的B 细胞等表面均有表达[1]㊂作为细胞表面受体，其在细胞之间㊁细胞内外的信号分子的相互作用起着十分关键的作用㊂
CD4分子具有重要的免疫学功能，它能够参与
机体的免疫应答㊂当抗原侵入机体以后，在细胞免
疫反应中，会被抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)识别并加工处理，然后以MHCⅡ⁃抗原肽复合物的形式提呈给CD4+T细胞识别，其中CD4分子起到辅助受体的作用，其识别的是MHCⅡ分子的非多态区[2]㊂在体液免疫反应中，抗原经APC递呈给CD4+辅助性T细胞，活化B细胞产生抗体，部分B细胞分化成为记忆性B细胞，当机体受二次感染时，就会产生免疫应答反应产生抗体抵抗抗原㊂因此,CD4分子在机体正常的免疫功能中起着重要作用,CD4分子也成为许多疾病的重要靶标[3]㊂另外，在HIV⁃1感染过程中,CD4作为首要的受体，起到了至关重要的作用㊂成熟的CD4分子与HIV⁃1表面的包膜糖蛋白gp120结合，然后引起包膜蛋白构象变化，进而与胞外的辅助受体CCR5或者CXCR4结
合，这样拉近了病毒与细胞距离，从而二者之间发生膜融合，进而病毒成功感染细胞[4⁃8]㊂因此，抑制HIV与CD4+细胞的结合成为HIV药物的热点之一㊂
CD4分子的不同功能，使其在各方面有了广泛的应用㊂最常见的是CD4胞外区与Fc融合形成融合蛋白，使得重组蛋白具有更长的半衰期，更适合于体内应用㊂例如Fc具有穿过胎盘㊁结合补体，还可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用及补体依赖的细胞毒性等㊂另外，将CD4与某些靶向分子融合，靶分子在CD4的介导下与靶细胞等目标物相结合，发挥靶向分子的效果[9,10]㊂此外,CD4抗体也被广泛应用，其中TNX⁃355㊁cM⁃T412㊁OKT4在某些疾病的临床中已发挥了重要作用[11]㊂大量的研究通过不同的表达系统，如原核表达系统㊁真核哺乳动物细胞表达系统等来表达可溶性的CD4 (只包括胞外区，不包括疏水穿膜区)[12]，制备CD4融合蛋白药物或抗CD4的抗体等运用于AIDS等其他相关疾病的研究[13,14]㊂但是这些表达系统表达纯化方法一般都太复杂，且存在一些如原核表达系统翻译后加工修饰系统不完善等问题㊂
本研究将全长CD4胞外区基因构建于杆状病毒表达载体，利用昆虫细胞表达系统进行CD4胞外区蛋白的表达，通过镍柱纯化即可获得高纯度的CD4蛋白，并对其抗原性与免疫原进行分析，结果显示其具有较好的生物学活性，这为HIV受体和感染的研究奠定基础㊂
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料㊁试剂 表达载体pAcgp67B由本实验室保存和构建；大肠杆菌DH5α为本实验室保存；昆虫细胞Sf9和High Five购自Invitrogen公司；单抗15A7由本实验室制备;HIV⁃1感染性克隆
NL4⁃3由朱桦教授馈赠，相应的病毒由本实验室生产保存;BALB/c雌鼠(6周龄)购自上海斯莱克实验动物有限公司㊂
1.1.2 工具酶㊁生化试剂及纯化介质 核酸相关工具酶购自TaKaRa公司;Gibson组装液由本实验室制备保存；转染试剂Cell Fectin Reagent购自Invitrogen公司；昆虫培养基购自Expression systems 公司;ELISA显液等材料购自北京万泰公司；质粒小提试剂盒㊁DNA纯化回收试剂盒购自TianGen；相关引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;Ni⁃NTA介质购自GE Healthcare公司㊂
1.2 方法
1.2.1 人重组CD4胞外区蛋白的构建与表达纯化 利用本实验室自行构建的pAcgp67B表达载体，进行引物设计(上游引物:pAc⁃CD4⁃F:5′⁃CATTCT⁃GCCTTTGCGGCGGATCCCATGAAGAAAGTGGTGCT⁃GGGC⁃3′和下游引物:pAc⁃CD4⁃R:5′⁃TCAGATCTG⁃CAGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCA⁃TGTGG
GCAGAACCTTGAT⁃3′)将CD4序列构建到重组质粒pAc⁃CD4中，并转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增㊂然后将重组质粒和线性杆状病毒共同转染至由无血清培养基培养的Sf9昆虫细胞中,12h后更换有血清的培养基，即可获得重组杆状病毒㊂再之后经过10cm细胞板㊁500ml锥形瓶的扩大培养，即可获得大量的重组杆状病毒㊂再利用现有的病毒感染High Five昆虫细胞，培养72h到96h后收获细胞上清，通过30kD的膜包进行浓缩，浓缩后上清经10000r/min离心去除沉淀，上清经Ni⁃NTA介质进行目的蛋白的纯化,50mmol/L咪唑洗脱杂蛋白, 250mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，最后将目的蛋白透析于PBS中保存㊂
1.2.2 人重组CD4胞外区蛋白的活性与均一性鉴定
1.2.2.1 蛋白均一性检测 将纯化获得的人重组CD4胞外区蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离鉴定，并用考马斯亮蓝染液染观察其组分均一性㊂同时通过电转仪将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液⁃1于4℃封闭10h到12h，再用一抗15A7室温孵育1h，之后用洗液漂洗3次，每次5min，二抗使用GAM⁃HRP室温孵育1h，同样漂洗3次后，显曝光拍照㊂
利用分子筛检测蛋白在溶液中的均一性：将样
品以0.5ml/min的流速通过G3000，记录蛋白样品不同组分的出峰情况㊂
1.2.2.2 ELISA检测活性 将纯化获得的蛋白以100ng的量包被于ELISA检测板上，之后将单抗15A7
以首孔10μg/ml的浓度3倍稀释12个梯度, 37℃孵育1h后，用洗液洗板5次后甩干，再加入GAM⁃HRP二抗,37℃孵育1h后洗板甩干㊂加入显液A液和B液37℃放置10min进行显, 0.2mmol/L浓硫酸终止显反应㊂然后置于双波长(450nm和630nm)读板仪下读取OD值，并用GraphPad Prism软件处理数据作图㊂
将本实验室制备保存的HIV gp120蛋白以200ng的量包被于ELISA检测板上，再将标记了生物素的CD4蛋白以首孔10μg/ml的浓度3倍稀释12个梯度，步骤同上，加入SA⁃HPR后，显终止㊂然后置于双波长(450nm和630nm)读板仪下读取OD值，并用GraphPad Prism软件处理数据作图㊂将CD4蛋白以首孔20μg/ml的浓度3倍梯度稀释，再与HIV⁃1病毒进行孵育1h，然后感染Tzmb1细胞㊂48h后固定细胞，显，利用Elispot 读板数点㊂
1.2.3 SPR法测定CD4与15A7结合活性 首先，偶联GAM至CM5：用70%的甘油Normalize CM5芯片2次,Prime1次后以HBS⁃EP为缓冲液，以5μl/min的速率用80μl EDC/NHS活化芯片4个通道，根据预结合确定的浓度与pH将GAM偶联至芯片4个通道(GAM60μg/mL，稀释于20mmol/L pH5.0醋酸⁃醋酸钠缓冲液，用量80μl)，用80μl的乙醇胺封闭芯片㊂最后用pH2.2~2.6的20mmol/L 甘氨酸⁃盐酸缓冲液洗以30μl/min的流速再生3次，每次再生5μl，把结合不牢固的GAM⁃Fc和乙醇胺洗下来㊂其次，摸索适当的单抗浓度㊁上样速率㊁上样量等使响应值在合理范围㊂本研究所使用的单抗上样流速为30μl/min，上样时间为3.7min㊂最后，进行待测样品抗原性检测，通过编写程序让Bia⁃core3000自动上样㊂
1.2.4 人重组CD4胞外区蛋白免疫原性评价1.2.4.1 BALB/c小鼠免疫 取6周龄BALB/c小鼠4只，采集眼球后静脉血，留作阴性对照血清使用㊂免疫原与弗氏佐剂混合乳化均匀，采取少量多点皮下注射免疫㊂初次免疫使用完全弗氏佐剂，免疫剂量为200μg/只，加强免疫使用非完全弗氏佐剂，免疫剂量为100μg/只㊂免疫周期为2周，每次免疫前1天，采集小鼠眼球血，以备后续检测使用㊂将血清于37℃静置30min后,12000r/min离心10min取上清血清，并冻存于-20℃备用㊂
1.2.4.2 免疫血清与抗原反应性检测 将免疫血清取1.5μl稀释于148.5μl20%NBS(含有20%胎牛血清的PBS)中，进行3倍梯度稀释，做ELISA检测免疫血清与抗原的反应性㊂
1.2.4.3 免疫血清中和能力检测 将免疫血清置于56℃水浴灭火30min，首孔取12μl血清溶于138μl DMEM培养基中，然后进行3倍梯度稀释，再与感染剂量为100个TCID50病毒孵育40~48h㊂之后弃上清，用含有1%甲醛和0.2%戊二醛的PBS 固定液固定细胞5min，再用75μl PBS清洗固定液两次㊂然后加入显液显,37℃孵育1h后用Elispot读板数点计数㊂
2 结果
2.1 人重组CD4胞外区蛋白的制备和鉴定 利用昆虫细胞表达系统来表达CD4胞外区蛋白㊂将本实验室留存的CD4胞外区基因序列，通过PCR和分子克隆技术导入到昆虫细胞表达载体pAcgp67B 中，然后利用杆状病毒进行表达㊂将昆虫细胞上清用镍柱纯化，纯化结果如图1所示,SDS⁃PAGE显示目的蛋
白分子量大小在50kD左右，其纯度约90%，产量约11.2mg/L，能够满足小鼠免疫的需求㊂Western blot结果显示CD4胞外区蛋白成功表达㊂
2.2 人重组CD4胞外区蛋白的活性分析 本研究通过体积排阻谱㊁酶联免疫吸附试验等技术对目的蛋白各方面性质进行鉴定㊂通过HPSEC检测，结果如图2A显示目的蛋白在溶液中均一性良好㊂经过ELISA检测结果显示,
本研究所获得的目的蛋白
图1 CD4蛋白的SDS⁃PAGE和Western blot结果Fig.1 SDS⁃PAGE and Western blot result of purified CD4protein
图2 CD4蛋白的理化性质结果Fig.2 Characterization of CD4protein
Note:A.HPSEC analysis;B.Antigenicity analysis using monoclonal
antibodies 15A7;C.Antigenicity analysis using HIV gp120;
D.Activity analysis using HIV virus;sCD4.Commercialized soluble CD4;CD4.CD4from this
study.
图3 CD4蛋白的免疫原性结果Fig.3 Immunogenicity of CD4protein
Note:A.Immunogenicity analysis using anti⁃CD4mouse serum;
B.Neutralization of anti⁃CD4mouse serum to HIV.
与目前市场上有的商品化可溶性CD4蛋白(soluble
CD4,sCD4)抗原性相当，如图2B 所示㊂同时如图
2C 所示生物素标记的目的蛋白与本实验室制备的
HIV gp120蛋白有很好的反应性，也说明该目的蛋白有较好的活性㊂通过CD4先与HIV 病毒孵育阻断病毒感染Tzmb1细胞，将目的蛋白以不同浓度梯度与HIV 病毒孵育，二者相互结合，然后感染Tzmb1细胞，结果如图2D 所示，说明目的蛋白能够与HIVNL4⁃3病毒结合，达到阻断HIV 病毒感染Tzmb1
细胞的效果㊂以上结果均表明，经镍柱纯化得到的目的蛋白在溶液中性质均一且有比较好的抗原性㊂ 利用SPR 法检测CD4与单抗15A7的结合活性，结果显示,K D =1.96×10-9,Chi 2=9.05，表明CD4与单抗15A7有良好的结合活性㊂
2.3 人重组CD4胞外区蛋白的免疫原性分析 为了检测获得的目的蛋白的免疫原性，使用纯化后的重组蛋白免疫BALB /c 小鼠，检测小鼠血清结合与
中和滴度㊂结果如图3A㊁B 所示，在第5针免疫之后，所有实验组小鼠(p1⁃p4)血清均与免疫原有较好的结合活性，且均对HIV NL4⁃3病毒具有不同程度的中和滴度㊂说明本研究的目的蛋白具有类似天然的构象，具有较好的免疫原性，可以有效地刺激小鼠体内的免疫应答产生中和抗体，可用于HIV 抗体以及受体等的研究㊂
3 讨论
人CD4分子在正常情况下，能够参与机体的免
疫防御㊁免疫自稳和免疫监视功能㊂但当其正常的免疫功能失调或者遭到破坏时，就会导致疾病[15]㊂
因此CD4分子以及CD4单抗成为许多疾病的靶标，如自身免疫病㊁移植排斥反应㊁肿瘤以及AIDS 等㊂能够在体外大量表达CD4蛋白对于攻克这些疾病的研究具有非常重要的意义[4,13]㊂
早在20世纪70年代发现CD4分子以来，人们
就开始尝试利用各种表达系统来表达CD4蛋白㊂最初从淋巴细胞表面分离，再到利用原核表达系统经大肠杆菌表达，以及利用真核表达系统哺乳动物细胞表达[16]㊂但这些表达纯化方法一般都比较复杂，且存在一些如原核表达系统翻译后加工修饰系
统不完善等问题㊂相比以往的研究报道，本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达CD4胞外区蛋白[17⁃21]，不仅培养操作简单㊁花费少，而且运用无血清培养基悬浮培养，具有易于扩大培养的优点㊂同时利用昆虫细胞内源的gp67信号肽实现目的蛋白的分泌表达，细胞上清利用镍柱一步纯化，即可得到纯度较高的目的蛋白，纯化方法简单快捷，每批次目的蛋白产量平均能够达到11mg /L㊂同时该昆虫
表
达系统表达的糖蛋白具有一定的糖基化修饰[22,23]，能够满足目的糖蛋白的表达需求，对于该系统表达
纯化得到人CD4胞外区蛋白，通过WB㊁ELISA㊁体积排阻谱等结果，表明目的蛋白具有良好的抗原性以及在溶液中均一性良好㊂另外，小鼠免疫实验结果说明目的蛋白具有良好的免疫原性㊂因此，利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，能够高效㊁简便㊁高量的表达纯化得到人CD4胞外区蛋白，能够为CD4分子以及CD4抗体等的研究提供充足的原料㊂随着对CD4分子相关功能和机制的深入研究,CD4分子跨膜区以及胞质区的功能逐渐被研究者挖掘，后续我们将尝试利用杆状病毒昆虫细胞表达系统进行CD4全长或其他功能区段蛋白的制备，为HIV 受体和感染等方面的研究奠定基础㊂
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[收稿2017⁃12⁃21 修回2018⁃01⁃16]
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