蚕业科学
第26卷 增刊
CANYE KEX UE
萨拉 帕克斯顿2000年 11月
周亚竞1,2 张志芳1 张元兴2 何家禄1
(1农业部家蚕生物技术重点开放实验室，中国农业科学院蚕业研究所，镇江212018;
2
生物反应器工程国家重点实验室，华东理工大学)
摘 要 综述了昆虫细胞培养技术、生物反应器、病毒感染与重组蛋白的表达，以及无血清和无蛋白 培养基的开发、昆虫细胞的稳定性表达等方面的研究进展。
关键词 昆虫细胞系 培养 基因表达 收稿日期2000205230
自Smith 等[1]创建了昆虫杆状病毒表达载体系统(Expression Vector System ,BE VS )以来，在短短的10多年时间内已成为生产与研究各种原核、真核蛋白的重要工具。许多重组蛋白的表达都要在昆虫细胞上进行，家蚕—家蚕杆状病毒表达载体系统也离不开细胞部分的工作。昆虫细胞培养是昆虫杆状病毒表达载体系统的基础工作。农业部家蚕生物技术重点开放实验室在研究家蚕宿主式生物反应器的同时，也对家蚕细胞大规模培养技术的建立进行了探索。本文拟对昆虫细胞培养技术、生物反应器、病毒感染与重组蛋白的表达、无血清和无蛋白培养基的开发以及昆虫细胞的稳定性表达等方面的进展作一归纳和讨论，期望为家蚕细胞培养研究提供参考。
1 昆虫细胞培养技术
细胞培养的关键是培养基配方的开发[2]，已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长，并用于繁殖杆状病毒。目前通用的商品培养基有
G race 氏培养基,IP L -41,T C -100，以及经改良的
哺乳动物细胞培养基T C199—MK 等。这些培养基呈液体或粉剂的商品，使用时通常补充5%～
10%胎牛血清和一些未测定的蛋白水解物或抽取
物等复杂添加剂。
大部分昆虫细胞都利用葡萄糖、果糖或麦芽
糖作为主要碳源和能源，在多数培养基中，葡萄糖作为碳源被迅速利用，蔗糖虽也可以利用，但它在培养基中主要作用是调节渗透压。不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求，有14种必需的氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而最后死亡，所以各类培养基中都含有较多的谷氨酰胺。昆虫细胞对有机酸的要求，其功能尚未明了。单独测试时只有苹果酸有生长促进作用。联合使用时，则对细胞生长有显著的促进作用。维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na +/K +比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe 2+、
Mn 2+、Cn 2+、Zn 2+、Al 3+等能促进细胞贴附和增加
产量，其中Al 3+和Zn 2+还可以促进病毒的感染和复制。水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate ,LH )和酵母提取物(Y eastolate ,Y L )是昆虫细胞培养基中最常用的添加物,Y L 是维生素和嘌呤的主要来源，
而LH 是不定成分氨基酸的主要来源[3]。
在昆虫细胞悬浮培养中还需添加一些多聚物如甲基纤维素、PVP —40、Duran 和Pluronic 多聚
醇，以保护细胞免受剪切应力的损伤和降低细胞结团。大部分鳞翅目昆虫细胞在25～30℃之间生长最佳。培养基pH保持在612左右，不需要C O2。多数昆虫细胞倍增时间为16～24h，在转瓶中培养时细胞最高密度可达2～5×106个/m L。
昆虫细胞生产系统需氧量很高，为提高氧传递率使用搅拌、通气等手段而产生的气泡和剪切应力往往引起细胞的损伤与死亡。因此，这个问题目前已成为昆虫细胞大规模培养的限制性因素。
2 生物反应器的应用及大规模病毒感染与重组蛋白的表达
由于昆虫细胞系来源于未分化的组织或某一器官组织，一般经过适应后，同一细胞系既可以贴壁生长，又可以悬浮生长，这种特性提高了昆虫细胞在培养方式和反应器类型的选择范围。如果是小型实验室可用摇瓶或转瓶进行悬浮培养，若是大型实验室或生产则可用气升式反应器或改进的搅拌式生物反应器。
气升式反应器的高与径之比一般为3∶1～12∶1，空气由反应器底部喷射进入中央提升筒，沿筒上升至液面脱离。由于筒内的气液混合液体密度小于筒外环境中液体的密度从而产生液体循环推动力，其结
果能在较低的剪切力下获得良好的混合效果。使昆虫细胞保持均匀悬浮。为避免细胞在喷射环境下死亡，以及防止气泡破碎而引起细胞死亡，培养基中需添加细胞保护剂如Fluronic2F68等。Weiss[4]在5～40L规模的气升式反应器中成功地培养了S f细胞,5L反应器中细胞密度达到614×106个/m L，而在40L反应器中达214×106个/m L。K ing等报道了在14L气升式反应器培养S f29细胞，其最高密度可达1×107个/ m L，但重组蛋白的产量低于小规模培养水平。在更大规模的气升式反应器中培养昆虫细胞，为了控制溶氧和保持反应器内流体的有效循环，必须提高空气喷射流速，但剪切应力成为限制因素。因此，在大规模气升式反应器内高密度培养昆虫细胞，是一个值得研究的问题。
搅拌槽生物反应器是当今生化工程领域的主要培养装置，其空气可以在液体表面通气，也可以在反应器底部通气，培养基内需添加甲基纤维素或Fluronic F68等保护剂。根据昆虫细胞培养特点，要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混和性能好，围绕这两项要求，已开发了不少形式的搅拌器，迄今为止，每年仍有不少这方面的论文和专利陆续发表。Sasaki[5]在搅拌浆上安装疏水性的聚丙烯膜以实现无泡通气搅拌，在这种改进的搅拌反应器内，以灌注方式(per fusion culture)培养S f221细胞，其密度可达2×107个/m L，对数生长期可维持7d以上。K amen[6]在11L带有螺旋浆式搅拌器的反应器内培养S f29细胞，这种搅拌器在低转速和低剪切的前提下，能获得良好的混合与传质效果。利用此装置，在表面通气的情况下，细胞密度可达到515～610×106个/m L，细胞活性高于98%,106个细胞中异源蛋白产量可达35μg。
由于相对低的细胞密度与产物浓度已在一定程度上限制了昆虫细胞的培养。目前，焦点之一是寻一种细胞培养方法，既能提高细胞密度又能增加细胞产物，同时能够降低生产成本。固定化昆虫细胞培养作为一项新技术，近年来发展很快,Agathos[7]采用胶原蛋白为基质的微珠来固定化培养蚊子细胞，密度高达2×107个/m L。K ing[8]采用海藻酸—聚L—赖氨酸制备微囊来培养昆虫细胞，细胞密度可达8×107个/m L。
固定化培养的另一有效方法是堆积床，为贴壁培养的一种方式，昆虫细胞贴壁生长在颗粒状球上，并在气升式反应器的降液区形成堆积床，而升液区则进行通气供氧。堆积床法由于可提高培养表面积，同时又能保持充足的供氧，因此有很好的发展前景。
多数场合，在昆虫培养细胞内生产野生型杆状病毒或用重组杆状病毒载体生产外源蛋白，都是作为间歇(batch culture)工艺流程进行的。因为所有细胞都因病毒感染的细胞病理效应(CPE)而死亡，用这一方法，往往可以简易地预测何时去收获感染细胞。迄今，连续或半连续生产杆状病毒的研究也已取得一定的进展。K urstak[9]首次设计了AcM NPV半连续生产系统，取得较好效果。其生产过程为：将Tn2368昆虫细胞先在一发酵罐B中作扩大培养，待细胞密度达1×106个/m L后，移115L细胞液至沉淀槽C中沉降，沉降后移1L 清液返回发酵罐B,C罐剩余物经混合均匀后移
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增刊 周亚竞等：昆虫细胞培养研究进展
入下一罐D，接种AcNPV并进行搅拌培养。每隔24h，由D罐依次转入E、F、G培养罐中继续培养，从而连续地增殖细胞和病毒。在此系统中一边供氧一边培养，在G罐中可获病毒滴度达1×108个/m L。K om pier[10]建立了杆状病毒生产的完全连续系统。这个系统包括两个连续搅拌反应器(CSTR)，其中CSTR1用于悬浮培养S f221昆虫细胞,CSTR2用于AcNPV2E L病毒的感染和增殖。两反应器之间通过硅胶管和蠕动泵连接。通过此系统悬浮培养S f221细胞25d，多角体病毒达107个/m L，非包涵体病毒可达108个/m L，细胞感染率为65%。K loppinger[11]综合了Hink的半连续系统和K om pier的完全连续系统，设计出一种简单而有效的杆状病毒生产系统———两阶段发酵系统，生产中进行灌注培养，病毒产量可达1125×107个/m L。
3 无血清和无蛋白培养基的开发目前昆虫细胞培养所用培养基一般均添加胎牛血清或牛血清，使得培养基成分变得复杂。同时，血清又是支原体和其他异源病毒感染的重要来源，这给基因工程表达产物分离纯化等后处理带来困难。
近年来，培养基的发展方向趋向于无血清或低蛋白培养基方面的开发，已先后研制出多种无血清或低蛋白培养基如SF M—5,C DM,SF—900Ⅱ,EX—CE LL400,ISF M等，但缺点是适用范围小。
C DC培养基[12]的出现，打破了无血清培养基的局限，它既可用于双翅目细胞培养，又可以用于鳞翅
目细胞系的培养，而且不需要预先的适应步骤，缺点是成份过于复杂。由于在无血清培养基中含有从血清或动物脏器中纯化的蛋白成分，如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和脂蛋白等，增加了分离纯化的难度和成本。一种以IP L—41基础培养基发展起来的无血清无蛋白培养基，在培养S f29细胞并感染重组AcM NPV的M-CSF(人巨噬细胞集落刺激因子)以生产M2CSF时，其产率相当高。
细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感，故需适当提高保护剂的浓度如Fluronic F68到013%。
无血清培养基的应用有时会降低重组蛋白的产量，在无血清培养基内，较高的细胞生长密度与相对较低水平的重组蛋白产量这一事实表明，促进细胞分裂的因子与促进重组蛋白生产的杆状病毒感染晚期起作用的因子是不尽相同的。无血清培养基配方还需进一步改进以便适应于重组蛋白的表达。
4 昆虫细胞杆状病毒表达系统的局限性
昆虫细胞—重组杆状病毒表达系统有其本身的局限性。由于外源基因的表达常发生在感染的晚期，此时宿主细胞许多功能受阻，蛋白加工能力已经降低。当使用的是杆状病毒晚晚期启动子时，高效表达的重组产物的加工可能是不完全的,Prehaud[13]报道用昆虫细胞—杆状病毒表达系统表达的狂犬病毒糖蛋白的糖基化作用不完全。
另一个明显局限性是，通过多次感染循环的长期连续传代后，病毒的感染能力会显著下降，称之为“继代效应”。产生的突变病毒干扰正常病毒的形成，这些所谓缺损干扰颗粒(DIP)需要野生型病毒作为辅助病毒才能复制。继代效应限制杆状病毒系统有限工作时间为1个月以内，此后多角体数目将明显减少[10]。Van Lier等用S f 细胞在反应器中连续生产杆状病毒时发现，容器数目增多加速了继代效应的出现，因此认为，间歇分批培养可能是重组蛋白生产的较好方法。
另外要考虑的问题是，在开发连续昆虫培养系统时，适合于大规模生产的昆虫细胞系不仅有鳞翅目昆虫细胞(杆状病毒的宿主)，还包括双翅目昆虫细胞，而这些双翅目昆虫(如蚊子)是许多重要疾病的媒介。与鳞翅目昆虫细胞—杆状病毒载体系统不同，双翅目昆虫细胞是外源基因产物长期稳定生产的首选者，这就要求双翅目昆虫细胞成为经得起检验的连续培养系统。
5 昆虫细胞的稳定性表达
Cuarino等[14]首先发现AcM NPV即刻早期蛋白IE1基因与39k蛋白迟早期基因的启动子在S f29细胞内能够诱导外源基因的瞬时表达。Jarvis[15]证明了这些启动子能够在昆虫细胞内指导外源基因的连续表达。Bernard[16]构建了一个
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重组果蝇S2细胞系，成功地表达了多种重组蛋白蒙古天韵
(蛋白表达受控于果蝇嗜金属硫蛋白启动子)，并
与杆状病毒/S f 29表达系统作了比较。在批培养的条件下，该细胞倍增时间为20h ，细胞密度能达
2×107个/m L 。其表达的7个跨膜结构蛋白多巴
陈宝成事件胺受体被正确地整合到S2膜上，并和带有[H 3]标记的螺环酮紧密结合，其药理特性与S f 29和动物细胞表达的完全一致。Angelichio [17]等比较了4种启动子(果蝇肌动蛋白5—C 末端启动子、α212微管蛋白启动子、果蝇嗜金属硫蛋白启动子
M tn 和家蚕丝心蛋白启动子)在稳定转化果蝇S2
细胞系中的表达效率，发现肌动蛋白52C 末端启动子和M tn 启动子产生相对较高的RNA 和蛋白，而α212微管蛋白启动子的水平要低4倍，家蚕丝心蛋白启动子检测不到活性。Deml 等[19]构建了两个转移载体系统用来产生稳定转化黑腹果蝇细胞DS 22，并使之表达乙肝表面抗原(H BsAg )。其中1个转移载体系统是由1个在可诱导的果蝇嗜金属硫蛋白启动子控制下的S 基因表达载体与1个带有选择性标记二氢叶酸还原酶(dhfr )基因的抗性质粒共转染,dhfr 基因受控于果蝇肌动蛋白52C 末端启动子。另一个转移载体系统是通过含有2个表达单元的单质粒进行共转染，这2个表达系统均适合用来产生稳定转化DS 22细胞系并释放高水平的H BsAg 。实验表明，从多克隆
DS 22细胞系表达的H BsAg 量和转染的S 基因转
移表达载体的浓度密切相关，且随不同的克隆细胞系而变化，最好的克隆株在无血清培养基条件下能达到7μg/m L 。K ovach [19]等还将携带含有融合到嗜金属硫蛋白启动子下的大肠杆菌β2半乳糖苷酶基因(Lac Z )的转录单元稳定地诱导进蚊子细胞C6/36，在这个异源系统中，受控于嗜金属
硫蛋白启动子的β2半乳糖苷酶的表达能被诱导和控制。
稳定转化果蝇细胞系中，在果蝇嗜金属硫蛋白启动子控制下能获得极高效表达外源基因的能力(如H BsAg 等)，在细胞培养方面，效果明显优于其他昆虫细胞。如转化果蝇细胞在批培养情况下即能获得高密度的细胞(2×107个/m L )，倍增时间短(20h )，并没有重组杆状病毒感染的细胞裂解和释放降解蛋白的蛋白酶而导致敏感蛋白的低产的问题，同时也避免了所谓的继代效应。在重组杆状病毒系统中，如前所述，如果外源基因的表达发生在感染的晚期，其高效表达的重组产物的加工有可能是不完全的。
目前，已能在Invitrogen 产品目录中查到商品化的稳定转化细胞表达系统。Insect Select 是一个简单而直接的表达系统，它无需杆状病毒感染就能获得高产量的表达，免除了斑纯化和重组杆状病毒母液的扩增，可在不到3周的时间内就能选择出表达所需蛋白的昆虫细胞系，并连续生产几个月，细胞不裂解也不释放蛋白酶。同时Insect
Select 单载体表达系统具有高表达的杆状病毒即
刻早期蛋白启动子、快速纯化稳定转化细胞系的
Zeocin 抗性基因、表达产物易于纯化和检测的C 2
末端融合标记。
随着基因工程的发展和细胞稳定转化方法的出现，使得提供能够连续不断表达外源基因的昆虫转化细胞系而无需病毒感染成为可能，这一方法已成功地用于鳞翅目和双翅目昆虫细胞系，用上述系统表达的产物其分泌性和糖基化程度远远优于BE VS 表达系统。由此可见，昆虫细胞稳定性表达系统不失为BE VS 系统的极好补充。
参
考
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Zhou Y ajing1,2 Zhang Zhifang1 Zhang Y uanxing2 He Jialu1
(1K ey Laboratory o f Silkworm Biotechnology,Ministry o f Agriculture,The Sericultural Research Institute,Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Zhenjiang212018;2The State K ey Laboratory o f Bioreactor Eingineering,East China Univer sity o f Science and Technology,Shanghai200237) Abstract The aspects of techniques for insect2cell cultivation,bioreactor,in fection of viruses and expression of recombinant proteins,development of serum2free and protein2free media,and ex2 pression in stably trans fected insect cell lines were overviewed in this paper.
K ey words Insect cell line s Cultivation Gene expre ssion
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