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罗宝正1，薄清如2，陈金顶3，王伟毅4，程 钢4，何蕴韶433
(1.中山大学中山医学院，广东广州,510080;2.珠海出入境检验检疫局，广东珠海,519015;3.华南农业大学兽医学院，广东广州,
510642;4.中山大学达安基因股份有限公司，广东广州,510080)
Expression of FMD V3ABC G ene in B ac2to2B ac B aculovirus Expression System L UO Bao2zheng1,BO Qing2ru2,CH EN Jin2ding3,WAN G Wei2yi4,C H EN G Gang4,H E Yun2shao433
(1.Zhongshan Medical College of Zhongshan Universit y,Guangz hou Guang dong510080,China;2.Zhuhai Ent ry2Ex it I ns pec2
tion and Quarantine B ureau,Zhuhai519015,China;3.V eteri nary College of S out h China A g ricult ural Universit y,Guang dong 510642,China;4.Daan Gene co.,L t d of Zhongshan Universit y,Guangz hou510080,China)
Abstract:The nonst ruct ural p rotein gene3ABC of Foot2and2mout h disease virus(FMDV)was amplified by reverse transcription(R T)PCR and t he PCR p roduct was inserted into t ransfer vec2 tor p Fast bac H T.Then,t he recombinant vector p Fast bac H T23ABC was ext racted and t ransfered into D H10Bac containing a shuttle vector Bacmid.3ABC gene was integrated into Bacmid by site specific t ranspo sition.Subsequently,recombinant shuttle vector Bacmid23ABC was t ransfected wit h Hi Five insect cells.Identification by PCR amplification demonst rated t hat3ABC gene was correctly inserted into baculovirus geno me at t he downst ream of polyhedrin promoter.SDS2 PA GE and Western blot analysis detected a band of about50kDa in t he exp ression product of 3ABC gene in insect cells.The successf ul exp ression of3ABC gene in Bac2to2Bac exp ression sys2 tem should p rovide a new technical platform for t he develop ment of novel approaches for distin2 guishing t he infected animals from vaccinated animals.
K ey w ords:Foot2and2mout h disease virus;No nstruct ural p rotein gene3ABC;Baculobivs Expres2 sion System;Expression
摘要：以O型口蹄疫病毒为研究对象，经过R T2PCP扩增得到非结构蛋白3ABC基因，克隆到转移载体p Fast2 bac H T，将其转入含穿梭载体Bacmid的D H10Bac，与Bacmid发生位点特异性转座作用，得到3ABC的重组穿梭载体Bacmid23ABC，再将其转染昆虫细胞Hi Five。PCR鉴定证实3ABC基因正 确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游，经过SDS2PA GE和Western blot检测,3ABC基因在昆虫细胞中表达了大小约为50kDa的蛋白条带,3ABC基因在Bac2to2Bac系统中的成功表达为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。 关键词：口蹄疫病毒；非结构蛋白3ABC；杆状病毒；鉴别诊断
中图分类号:S852.65 文献标识码:A 文章编号:100325125(2005)0320303204
口蹄疫(Foot2and2mout h disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot2and2mout h disease vi rus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。患病动物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位发生水泡，破溃弄形成烂斑。人和非偶蹄动物也可感染该病，但症状较轻。FMDV有A、O、C、Asia21、SA T1、SA T2和SA T3等7个血清型，各血清型之间无交叉免疫现象。该病在世界范围分布广，感染率高，传播迅速。由于口蹄疫对畜牧业发展造成巨大的危害，国际兽疫局(OIE)将其列为A类传染病之首。欧盟国家虽然从1991年以来已经禁止接种疫苗，但是在疫情暴发的时候仍需要进行紧急接种。无论接
收稿日期:2004212210，修回日期:2005203203
作者简介：罗宝正(1975-)，男，山东青岛籍，博士生，主要从事病原体基因诊断方向的研究。33通讯作者.Corresponding aut hor.Tel:020*********,E2mail:yshe@gzsums.edu
受过免疫与否，猪都可以成为病毒的携带者，因此，有必要在出现疫情的时候鉴别诊断自然感染和免疫猪。在FMD流行并且进行常规免疫的国家，鉴别自然感染和免疫动物对于控制疫情进而根除口蹄疫显得更为重要。
1966年Cowan等人鉴定到FMDV的一种非结构蛋白V IAA(virus infection associated antigen，后来证实是3D蛋白)可以通过血清反应区别自然感染和免疫动物[1]。由此建立的免疫扩散试验与动物食道咽部病毒分离技术相结合曾一度被认为是一种可靠的鉴别诊断方法。但后来发现，重复接种灭活疫苗的动物体内会不同程度地产生抗V IAA抗体[2]，因此该方法受到质疑。于是，很多研究人员将目标转移到FMDV的其它非结构蛋白，如2C、3AB 和3ABC等[3～5]。其依据是，疫苗中的主要成分是结构蛋白，非结构蛋白3ABC、3AB和2C等在疫苗的制作过程中随着抗原的纯化被去掉，因此注射疫苗几乎不可能诱导动物机体产生非结构蛋白的抗体[6]。Mezencio等证明猪的3ABC抗体比2C抗体衰退的要慢，猪感染FMDV后一年还可以检测到3ABC抗体[7]，并且注射疫苗的动物偶尔也能检测到2C抗体。研究人员最终认为非结构蛋白3ABC 抗体是检测FMD感染的最可靠的指标。国外已经有很多实验室建立了利用大肠杆菌和杆状病毒表达的蛋白检测3AB和3ABC抗体的方法[5,8,9]。在国内，曹轶梅[10]等以在大肠杆菌中表达的3ABC蛋白为抗原建立了鉴别自然感染与免疫动物的间接EL ISA方法。在本研究中，我们克隆了口蹄疫病毒3ABC基因并在杆状病毒系统中进行了表达，期望为自行研制鉴别诊断E LISA提供大量的3ABC蛋白。
1 材料与方法
1.1 病毒和细胞
FMD病毒株为O型口蹄疫病毒的细胞培养毒。B H K21(仓鼠肾传代细胞)由广州出入境检验检疫局赠送。
1.2 FMD病毒基因组RNA的提取
细胞毒经12000r/min冷冻离心15min后，弃掉培养液，加入1mL提取液(Trizol)，反应管室温放置15～20min(或4℃较长时间)，加入0.2mL氯仿/ 1mL提取液，用力震荡15s，室温静置10min，在4℃下12000r/min离心15min。小心将1/2～1/3体积上层水相转移到一干净离心管中，加等体积异丙醇, -20℃静置20min(或过夜),12000r/min离心15min。取上清，加入1mL75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀,4℃、10000r/min离心5min，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在空气中干燥10min，用适量无RNase的纯水(D EPC处理过的蒸馏水)溶解沉淀。
1.3 引物、探针的设计与合成
从GenBank中获得口蹄疫病毒基因组序列，用Oligo6.0设计引物，引物合成在上海生工公司完成。上游引物:5′2CA GGAA T TCA T T TCAA TCCC T TCCCA GAA23′；下游引物:5′2TC AAA GC T T TCAC
AACCCCTC GT GGT GT GG23′；上游引物的5′端加有保护碱基和Eco RⅠ酶切位点，下游引物的5′端加有保护碱基和Hi ndⅢ酶切位点。其中下游引物作为逆转录引物。
1.4 RT2PCR
用晶美公司的逆转录试剂盒进行第一链cDNA 的合成，方法按照试剂盒说明书进行。取2μL提取的核酸溶液在PE9600上进行PCR反应，反应条件为93℃预变性2min，然后93℃30s,57℃30s,72℃120s,35个循环，最后72℃10min延伸。产物经1%的琼脂糖凝胶电泳。
1.5 3ABC基因的克隆与转座
3ABC的PCR产物T克隆到pMD218载体，送博亚公司测序。PCR产物进行Eco RⅠ和Hi ndⅢ(Fermentas公司)双酶切，切胶纯化(Q IA GEN公司切胶纯化试剂盒)之后与同样酶切的p Fast b ac H T进行连接过夜，转化感受态D H5α(本实验室保存)。
挑取阳性克隆扩大培养，提取质粒p Fast b ac H T23ABC，转化感受态D H10Bac(含Bacmid)。挑取白菌落培养，用M13引物进行PCR鉴定(M13引物位置见图1)
。
图1 重组杆状病毒构建
Fig.1 Construction of recombinant Bacmid
(PCR Prodact priduced by M13primers is2300bp plus t he size of t he insert3ABC).
1.6 表达与鉴定杨宪益 戴乃迭
Bacmid23ABC转染昆虫细胞Hi Five，上清中收获重组杆状病毒颗粒，感染Hi Five昆虫细胞。细胞裂解后进行SDS2PA GE和Western blot鉴定。
403 中国病毒学 第20卷
p Fast bac H T 、D H 10Bac 和昆虫细胞Hi Five 由中山
大学生物防治国家重点实验室王 章教授赠送。
2 结果
2.1 RT 2PCR 、克隆及其鉴定
R T 2PCR 产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，出对时网
现一条约1300bp 大小的条带，与预期的大小相符。PCR 产物T 克隆之后测序结果与H KN/2002株(A Y317098)同源性最高(96%)，所得序列提交GenBank 。重组载体p Fast bac H T 23ABC 的酶切与PCR 结果与预期相符(图2)
。
图2 重组质粒p Fastbac H T 23ABC 的酶切与PCR 鉴定
Fig.2 Identification of recombinant p Fastbac H T 23ABC by
enzyme digestion and PCR
M ,DNA Marker ;1,p Fastbac H T 23ABC/Eco R Ⅰ;2,p Fastbac H T 23ABC/Eco R Ⅰ、Hin d Ⅲ;3,PCR product of p Fastbac H T 23ABC.
2.2 转座
重组载体p Fast bac H T 23ABC 转化感受态D H 10Bac ,PCR 鉴定结果。由于PCR 引物位于Bac 2mid 中mini att Tn7两端序列，所以在未经p Fast 2Bac H T 23ABC 转化的D H 10Bac 中,Bacmid 的PCR 扩增产物为大约300bp 的DNA 片段，转化之后的D H 10Bac 中，重组Bacmid 23ABC 的PCR 扩增产物为大约3700bp 的DNA 片段(图3)，与预期值相符，重
组正确。
图3 PCR 鉴定Bacmid 23ABC
Fig.3 PCR analysis of bacmid 23ABC
M1,500bp DNA Marker ;122,PCR product of Bacmid 23ABC ;3,PCR
product of Bacmid ;M2,100bp DNA Marker.
2.3 表达及鉴定
提取重组病毒Bacmid 23ABC 感染Hi Five 细胞,SDS 2PA GE 分析表达蛋白，比对照组多出一蛋
白条带，分子量约50kDa ，与3ABC 融合蛋白的大小
一致(图4)。Western blot 显示该蛋白能与抗口蹄疫病毒的抗体反应，证实3ABC 基因得到了表达(图5)
。
图4 感染Hi Five 细胞72h 之后细胞总蛋白锂合金
Fig.4 SDS 2PA GE analysis of the total cellular proteins of
Hi Five cells 72h post infection
M ,Protein marker ;1,Hi Five cells ;2,Hi Five cells infected wit h
Bacmid 23ABC ;3,Hi Five cells infected wit h
Bacmid.
图5 表达蛋白的Western blot 鉴定
Fig.5 Identification of expressed protein by Western blot
1,Hi Five cells infected wit h Bacmid 23ABC ;2,Hi Five cells infected
wit h Bacmid.
3 讨论
目前常用的FMDV 抗体检测是基于结构蛋白和全病毒的诊断方法，但这些方法难以区别感染和免疫动物。本研究用基因工程技术生产重组3ABC 蛋白，可望替代全病毒抗原建立重组3ABC 蛋白2EL ISA ，将给我国的FMD 监测和普查带来极大便利，具有十分广阔的应用前景。此前，我们用原核系统对FMD 病毒3ABC 基因进行了表达，尽管表达效率较高，但由于重组蛋白的纯化比较困难，残留的大肠杆菌抗原成分会与动物体内的大肠杆菌抗体发生非特异性反应[11,12]，而且在大肠杆菌中表达的蛋白常常形成所谓“包涵体”，需将它们用变性剂溶解后小心地复性才能保持其生物学活性。因此，本研究选择了与哺乳动物无交叉抗原的昆虫杆状病毒表达系统取代大肠杆菌表达系统。
多数情况下，昆虫杆状病毒系统中表达的重组蛋白在细胞中进行了加工、修饰，并且在细胞中定位
5
03 罗宝正，等：昆虫杆状病毒系统表达口蹄疫病毒3ABC 基因
下来。近几年来，对昆虫杆状病毒转移载体的改造也取得了较大突破,Bac2to2Bac系统大大缩短重组病毒的纯化时间。用传统的B EVS(Baculovirus ex2 pression vector systems)表达蛋白，重组病毒的获得需要多轮的空斑纯化，而用新型的Bac2to2Bac系统，基因操作完全是在大肠杆菌中进行，得到的重组子可以直接感染培养的昆虫细胞，大大提高了工作效率并节省了时间。与其他真核表达系统相比，昆虫杆状病毒系统中目的基因表达效率高，其表达产物为N末端带有6个组氨酸残基的融合蛋白，可用镍螯合树脂简易地纯化重组蛋白。另外，杆状病毒的宿主范围窄，仅限于特异的无脊椎生物，对脊椎动物没有感染力，因而比其它哺乳动物病毒更加安全。
我们用O型口蹄疫病毒做为模板，经过R T2P CR得到了3ABC基因，通过转座将3ABC基因克隆到杆状病毒载体上并在昆虫细胞中进行表达。经Western blot鉴定，证实得到的是特异性蛋白，为建立3ABC蛋白EL ISA进而拥有我国自主知识产权的FMD鉴别诊断技术奠定了一定的基础。
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603 中国病毒学 第20卷
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