生物防治-04昆虫病毒

昆虫病毒及其应用
全世界从1100多种昆虫中发现了1670多种昆虫病毒。我国已从7个目35科196种昆虫中分离到243株昆虫病原病毒。目前进入大田推广或示范阶段的病毒杀虫子剂约20种,棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂是我国第一个商品化且登记注册的病毒杀虫剂。斜纹夜蛾NPV、黄地老虎GV杀虫剂及菜青虫GV杀虫剂等昆虫病毒杀虫剂均已注册,并有一定应用面积。
昆虫病毒的研究历史:昆虫病毒病的研究由来已久,最初是对家蚕和蜜蜂疾病的研究开始的,家蚕的高节病、脚肿病,目的是如何控制昆虫的病毒病。我国70年代开始,(中国农科院武汉病毒研究所)开始研究用昆虫病毒来防治农、林害虫。
病毒防治害虫成功例子:欧洲云杉叶蜂在加拿大东部和美国东北部,曾猖獗一时,导致云杉林木的巨大损失。一种该虫的核型多角体病毒随着昆虫天敌从欧洲引入加拿大,迅速传播,形成流行,有效地控制了这种叶蜂的危害。昆虫病毒施于田间后,在一定的自然条件下,能起到长期控制害虫的作用,逐渐受到重视。
一、昆虫病毒的类
1.昆虫病毒的一般构造
在了解植物病毒的基础上:蛋白质和核酸(多数是RNA)。
病毒是一类没有细胞构造的生物体,其主要组成是核酸和蛋白质。病毒个体称为病毒粒子,由两部分构成:中央是核心,成分为核酸;外层是被壳,成分是蛋白质。病毒粒子的形状有的为杆状,有的为近球形。
智能卡阅读器昆虫病毒与植物病毒的不同:多数昆虫病毒有包涵体。病毒粒子被包封在由蛋白质组成的包涵体内,称为包涵体病毒(watermelon)。包涵体的形状有:多角体、颗粒状,在寄主脂肪、肠壁、真皮、肌肉以及其它组织细胞的核或细胞质里增殖。包涵体的大小以微米计算,在光学显微镜下可见,但颗粒体病毒刚刚能被观察到。病毒粒子只有在电子显微镜下才能看到。没有包涵体的称为无包涵体病毒。
网上学习系统核酸:一种病毒只含有一种核酸,RNA或DNA,核酸有单股和双股之分。动物病毒中RNA病毒以单股多,DNA病毒以双股多。(大多数植物病毒为单股的RNA病毒)。
2.昆虫病毒主要类型(两种方法,从不同的角度)
二十世纪七十年代,昆虫病毒的分类,就是根据包涵体的有无、形态、生成部位等特点,而大体分成五类:
海安县紫石中学(1)核型多角体病毒(Borrelinavirus属),多角体于细胞核内形成;Nuclear Polyhedrosis Virus NP
V (2)质型多角体病毒(Smithiavirus 属),多角体于细胞质内出现;Cytoplasmic Polyhedrosis Virus CPV (3)颗粒体病毒(Bergoldiavirus 属),椭圆形颗粒状包涵体存在于细胞核或细胞质内;Granulosis Virus GV (4)昆虫痘病毒(Vagoiavirus 属),椭圆形与纺锤形包涵体存在于细胞质内,但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的;Entomopoxvirus EPV
(5)非包涵体病毒(Moratorvirus 属),不形成包涵体,病毒粒子游离地存在于细胞质内或细胞核内。
这种分类法,是由于研究昆虫病理学时,病毒只作为病原体对待而历史地形成的,即使现在,仍未失去其实际意义。然而,随着昆虫病毒的数量和种类的发现日益增加,对这种分类法进一步完善和逐渐成熟起来,最近(1999)根据“Virus taxanomy1999”,昆虫病毒可分为7个科。
1、杆状病毒科(Baculoviridae)
核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)
颗粒体病毒属(Granulovirus)
2、呼肠孤病毒科(Reoviridae)
质型多角体病毒属(Cypovirus)
3、痘病毒科(Poxviridae)
昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)
4、细小病毒科(Parvoviridae)
浓核病毒亚科(Densovirunae)
5、虹彩病毒科(Iridoviridae)
虹彩病毒属(Iridovirus)
6、弹状病毒科(Rhabdoviridae)
西格马病毒属(Sigmavirus)
7、微核糖核酸病毒科(Picornaviridae)
肠道病毒属(Entervirus)
其中:核型多角体病毒和颗粒体病毒属于杆状病毒科;痘病毒属于痘病毒科;质型多角体病毒属于呼肠孤病毒科。
二、核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus,简称NPV)
(一)形态及病理特征
属于杆状病毒科。核型多角体病毒,故名思义,包涵体是在细胞核里形成的。该类病毒可侵染脂肪体、体壁的皮细胞、气管、肠壁细胞等组织细胞的细胞核,并在其内增殖。是昆虫病毒中发现最早,研究得较详细的一类病毒。早在几个世纪以前,蚕农发现一种危害家蚕的疾病,俗称脓病,就是核型多角体病毒引起的。中国蚕农知道脓汁可感染健蚕。现在知道,家蚕脓病是一种典型的核型多角体病。其特征之一是染病组织的细胞核内形成许多病毒包涵体,即多角体。发病后期,染病组织的细胞核破裂,流出乳白脓汁样的血液。1912年才知道脓病是病毒病。
寄主范围:在已分离出的248种NPV中,绝大部分是从鳞翅目昆虫中分离出来的(243种),其次是膜
翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目。我国已从一些重要害虫上发现的NPV有棉铃虫、甜菜夜蛾、小地老虎、棉小造桥虫、黄刺蛾、大蓑蛾、桑毛虫、烟青虫、天幕毛虫、甘蓝夜蛾、斜纹夜蛾等。
症状:初期外部症状不明显。发病后体变淡、发白,逐渐丧失食欲,感染后4天开始死亡,5-7天为死亡高峰期。最后体内组织液化,体壁脆弱易破,流出脓汁样体液,但无臭味。野外发生流行病时,昆虫常向植物上部转移,爬到树顶,倒悬其上而死。
NPV侵染的主要途径是经幼虫口食入,包涵体在易感虫体的中肠内迅速被溶解,碱性环境易于溶解。游离的病毒粒子侵入中肠肠壁细胞,并在细胞核内繁殖,其内产生的病毒粒子进一步侵染其它组织细胞。棉铃虫NPV主要侵染幼虫的血细胞、脂肪细胞、气管、马氏管、神经节和表皮细胞等。最后在核内形成包涵体。
组织变化:病毒在细胞核内增殖,细胞核膨大,染质凝聚成块,随后出现病毒发生基质,在发生基质的周围形成杆状的核衣壳。核衣壳获得囊膜进入多角体蛋白中。由于病毒的增殖,核内充满多角体,核膨胀,破裂,细胞瓦解,多角体进入血淋巴中。ppva
(二)核型多角体病毒杀虫剂的生产
当前在国际上已注册或商品化的NPV病毒杀虫剂有7种,其中防治农作物的有4种,防治森林害虫的有3种。在我国,只有棉铃虫NPV杀虫剂实行了商品生产并注册。如美国有五种NPV进行工厂化生产:棉铃虫、叶蜂、莲纹夜蛾、粘虫、尺蠖,其中五种商品化生产,用于大田害虫的防治(棉铃虫、叶蜂、尺蠖)。很多国家都有用NPV成功的例子。
我国情况:棉铃虫NPV制剂商品化生产。
1.昆虫病毒制剂的生产方法:病毒是特异性寄主细胞内的寄生物,只能在寄主细胞内增殖。
(1)利用昆虫细胞系:昆虫组织培养技术,有可能用来大规模生产昆虫病毒制剂。优点:产品纯净,无污染;缺点:成本高,若干技术问题未解决。目前昆虫细胞系只用于昆虫病毒理论的研究。目前用于工程病毒来生产医用的蛋白质。
(2)活体生产:目前大量生产病毒制剂,还只能利用活体昆虫,接种病毒,进行病毒的再生产。也就是需要大量饲养昆虫。昆虫有些可用人工饲料饲养,有的还只能用天然饲料。棉铃虫等具有自相残杀习性的昆虫,应单头饲养。这些也限制了昆虫病毒杀虫剂的发展。
世界上第一研究成功的病毒杀虫剂,是美洲棉铃虫病毒杀虫剂,最早建立以半合成人工饲料大量饲养棉铃虫生产病毒,使病毒杀虫剂的工厂化生产成为可能。我国,1985年在湖北建立了我国第一座半机械生产的中间试验工厂。前几年在河南、河北、湖北等地建立了生产棉铃虫NPV病毒杀虫剂的工厂。
2.工厂化生产工艺:我国病毒杀虫剂的生产工艺经历了三个发展阶段
20世纪70年代:感病虫尸捣碎—过滤去渣—悬浮液—直接用于大田防治的初级阶段。
80年代为:感病虫尸机械磨浆过滤—离心提纯—干燥—粉碎过筛—标定含量—添加辅助剂拌合—分装。
90年代后在剂型研制上有了进展,目前病毒杀虫剂的剂型有可湿性粉剂、乳剂、乳悬剂、水悬剂等。
人工饲料的配制、接种、病死虫的收集、剂型加工、产品检验和分装。
辅助剂:辅助剂是配制病毒杀虫剂的重要成份,通常包括增效剂、保护剂、展着剂、粘着剂、幼儿剂和填充剂等。我国所研制的病毒杀虫剂中选用的辅助成份如下:
歼8t增效剂:西维因、杀灭菊酯、硫酸铜、硫酸锌等
保护剂:翠蓝、果绿、活性碳等
展着剂:中性洗衣粉、十二烷基硫酸钠等灵魂之语
诱饵剂:棉铃虫用棉油、棉叶粉等
填充剂:碳酸钙、白陶土、高岭土、硅藻土等
乳化剂:吐温—20、656H等。
简单介绍棉铃虫NPV的生产:饲养、接种、收集、提取、拌合及分装,质量检验(病毒含量检测、毒力生物测定和杀虫效果检验、病原病毒纯度检验、卫生指标检定、对实验动物的毒性及致病性检查。
(三)核型多角体病毒的重组及基因工程病毒杀虫剂
近年来,杆状病毒尤其是核型多角体病毒分子生物学的研究受到重视。杆状病毒作为一个新开发的真核细胞表达载体系统,已成功地在离体昆虫细胞或虫体中高水平表达来自细菌、病毒和人的近百种外源基因,用来生产医用蛋白。
核型多角体病毒作为杀虫剂都有一个弱点,就是杀死害虫的时间较长(5-6天以上)、杀虫谱窄。由于这个原因,使病毒杀虫剂的商品化和推广应用受到限制。在分子生物学研究的基础上,利用现代生物技术,通过病毒基因组的突变或在基因组中导入干扰昆虫代谢和加速死亡的激素、酶、苏云金杆菌杀虫晶体蛋白以及对昆虫转型的麻痹神经毒素编码基因,均有可能改良核多角体病毒的杀虫效果。例如,中山大学生物防治国家重点实验室与中国农科院生物技术研究中心合作,人工合成一种对昆虫专性的蝎子麻痹神经毒素基因和苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白信号肽编码序列,构建了一株既能表达该病毒又能表达麻痹神经毒素,使受感染的昆虫在2-3天内麻痹,停止危害作物,但病毒还能正常增殖,最后杀死害虫,所以是一株具有开发和应用前景的重组昆虫病毒。我国采用利尿激素基因、昆虫保幼激素酯酶基因、
Bt杀虫蛋白基因、蝎神经毒素基因等构建的重组病毒杀虫剂大大缩短了害虫致病时间,防治效果显著。
三、其它昆虫病毒
1.昆虫痘病毒
Entomopoxvirus,简称EPV,于1963最早在鞘翅目昆虫中发现。现已在鳞翅目、双翅目、鞘翅目与直翅目昆虫中发现了50多株痘病毒。已定名24种。我国已发现昆虫痘病毒9株。在自然条件下昆虫痘病毒能引起流行病。有时感染率达50%。EPV在脂肪体、血球、体壁皮细胞的细胞质中增殖,包涵体椭圆形。是最大的包涵体病毒。
症状:行动迟缓,发育期延长,食量下降,产卵量下降,脂肪体肥厚,在后期呈不规则松弛状,灰白、虫体变硬
2.颗粒体病毒(Granular Virus,简称GV)握我国研究较详细的是小菜蛾颗粒体病毒、小菜粉蝶GV。昆虫感染GV后,症状与NPV相似,如食欲减少,行动迟缓,腹部肿胀,刚死的幼虫头部下垂,口腔内向外吐出粘稠液体。但因病毒增殖的部位不同而伴有各种颜的变化。如菜粉蝶幼虫被感染后,体由深绿逐
渐变为微黄、黄绿、乳黄,腹部乳白。
3.质型多角体病毒 Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,简称CPV
病毒只在细胞质中增殖,病毒粒子呈球形。质形多角体病毒病最早发现于家蚕中,
症状:初期,外部症状很不明显,逐渐地体形弱小,食欲减退,三体段比例不正常,有时体变化明显,但虫尸体壁完好,不液化。
四、昆虫病毒的感染途径和传播方式
1.感染途径
通过污染食物而经口感染,是自然界昆虫病毒传播的主要途径。病毒粒子被包埋在包涵体内,如果没有碱性胃液的作用,使多角体蛋白溶解、释放出病毒粒子,就不能引起感染。不论核型多角体、质型多角体、颗粒体、痘病毒经口接种,都可得到很高的感染率。包涵体在中肠内被碱性胃液溶解,释放出病毒粒子,在体内有再侵染过程。
提取病毒粒子时,用PH11.2的缓冲液裂解包涵体,然后离心。
2.传播途径核型多角体病及颗粒体病的病虫,体内容物最后大部分液化,这些病虫体壁破裂后流出的脓汁,有强烈的传染性。而且因颗粒体病毒液化的尸体,对甘蓝夜蛾有诱食作用,据报导,甘蓝夜蛾特别贪食留有病虫残迹的叶片。
质型多角体病虫的粪便带有大量病毒,特别在发病后期,大量多角体、游离病毒粒子、被解体的中肠细胞碎片,随粪便一起排出体为,污染食物,成为强烈的病毒感染源。易发生流行。
3.潜育期
从病毒感染到发病,即呈现明显的外部病症,需经过一定的时间,称为潜育期。潜育期与感染虫期与病毒剂量有关。以NPV为例
发育阶段不同,潜育期长短不同,一般低龄感染,潜育期短。如家蚕一龄幼虫感染,3-3.5天发病;
的值越小,害虫发病早,死用病毒制剂防治害虫,潜育期与半数致死时间很重要,潜育期越短,LT
50
亡快。这也是生防上,人们对NPV更感兴趣的原因之一,即其它昆虫病毒的潜育期较长。
潜育期与虫种、虫龄、病毒量、虫体的健康状况有关。
克服潜育期长的途径:选育高效毒株、增加用量、复合制剂、遗传改良等。
接种量不同,潜育期不同,量多时,潜育期3-6天,低时延长至10-14天。
(养蚕业上,家蚕大规模饲养时,蚕密集在一起,CPV 通过少数感染病毒的病蚕陆续排粪,污染叶片,不断引起经口感染,结果造成蚕病爆发。)
此外昆虫病毒还可经伤口感染。
3.昆虫病毒病的诊断鉴定
(1)形态学和组织学方法光学显微镜检查是否有包涵体产生。
(2)生物鉴定方法可用感染试验方法鉴定病毒的存在。如不产生包涵体的病毒,通过同种昆虫经口服或穿刺接种,观察能否复制出相同类型的病征。如接种后能够引起健虫发生同样的疾病,而又排除
了其它类型病原微生物的可能,则可进一步采用其它方法鉴别病毒的类型。
(3)电子显微镜观察
(4)血清学方法
五、昆虫病毒与害虫的生物防治

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