一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法） 1、试剂配制
（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1] （3）硫酸钾浸提剂[c玻璃模具（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。
（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。
（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。
（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4COagps是什么意思2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。
2、仪器设备
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。 3、操作步骤
（1）土壤前处理
新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径 < 2mm）并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。将土壤置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1mol L-1 NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，但分析前需在上述条件下至少再培养24h。
（2）熏蒸
称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土壤3份，置于80ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入
一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。用熏蒸抽真空装置（也可采用无油真空泵，如DOA-P181-BN型真空/正压泵）抽真空，在–0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于空气进入应该有明显的声音；否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。
取出土壤和氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器，同上反复抽真空（–0.07MPa）直到土壤无氯仿味为止；否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。一般需要反复抽真空5～6次，每次3min，每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。
（3）浸提
将熏蒸土壤无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25℃，300r min-1）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于125ml塑
料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于200ml聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在–18唐健生℃下保存。
（4）测定
取10 ml土壤浸提液于40ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），使浸提液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采用碳–自动分析仪（Phoenix 8000）测定样液有机碳含量。基本过程：先在样液中通入高纯度氮气5～10min，以除去溶解在浸提液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步去掉残留的CO2，然后样液进入紫外氧化管，在紫外灯以及过硫酸钾溶液和磷酸溶液的作用下，浸提液中的有机碳全部氧化为CO2并释放出来，产生的CO2经一系列纯化后通过红外检测器测定。载气为高纯度氮气。详细操作步骤参见仪器使用说明。
工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，用双蒸水定容。即得0、20、40、60、80、100mg C L-1系列
标准碳溶液。分别吸取上述不同浓度的标准碳溶液10ml于40ml样品瓶中，按上述相同方法测定。
（5）结果计算
土壤微生物生物量碳：B非同凡响的爱C = EC / kEC
式中：EC = 熏蒸土壤浸提的有机碳 – 不熏蒸土壤浸提的有机碳；
kEC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。
二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）
1、试剂配制
（1）去乙醇氯仿：同上
（2）硫酸钾浸提液：同上
（3）硫酸铬钾还原剂：硫酸铬钾还原剂（5%）：50.0g分析纯硫酸铬钾，溶于200ml分析
纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84g ml-1），用蒸馏水稀释到1L。
（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）= 0.19mol L-1]：30.324g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水，定容至1L。
（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10mol L-1]：400g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水，定容至1L。
（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4mol L-1]：160g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水，定容至1L，过滤（<0.45µm）。
（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 0.01mol L-1]：2.5ml 4mol L-1 NaOH溶液用谱纯水稀释至1L。
（8）硼酸溶液（2%）：20.0g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水，定容至1L。
（9）硫酸溶液[c（H2SO4）= 0.05mol L-1]：28.8ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84g ml-1）用蒸馏水稀释定容至1L，此溶液硫酸浓度为0.5mol L-1，将该溶液稀释10倍即可得到0.国家质检总局缺陷产品管理中心
05mol L-1硫酸溶液，再用0.1mol L-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。
（10）指示剂贮存液：1.0g氨混合指示剂溶于10ml 0.01mol L-1 NaOH和10ml 95%乙醇混合液，用双蒸水定容至200ml。此贮存液可保存1个月。
（11）指示剂溶液：10ml指示剂贮存液用双蒸水稀释定容至500ml，过滤（<0.45µm）。此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。
（12）氯化铵标准贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000µg N ml-1]：3.8190g分析纯氯化铵（称量前经105℃烘2供求2000～3h）溶于双蒸水，并定容至1L。此贮存液可稳定保存数月。
（13）氯化铵标准溶液[ρ（NH4Cl）= 50µg N ml-1]：10ml 1000µg N ml-1氯化铵贮存液用双蒸水稀释至200ml。此溶液最多保存7d。
2、仪器设备
流动注射氮分析仪（FIAStar5000，FOSS公司）或定氮仪、pH自动滴定仪、真空抽滤瓶，微孔滤膜（<0.45µm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。
3、操作步骤
（1）土壤前处理、熏蒸、浸提同上。
（2）消化：取10.0ml浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250ml消化管中，加入0.2ml 0.19mol L-1 CuSO4溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物，混合液消化变清后再回流3h。
（3）消化液中氮的测定：消化液冷却后，用双蒸水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml，待冷却后缓慢加入10ml 10mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀，以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH3的损失，再用双蒸水定容至100ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000型）测定。采用40µl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为双蒸水，试剂Ⅰ为4mol L-1 NaOH溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。校正曲线溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 50µg N ml-1氯化铵标准溶液于100ml容量瓶中，再分别用双蒸水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样液。然后用双蒸水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.
0、2.5µg N ml-1系列氯化铵标准溶液，采用测定KTN方法模块测定和制备校正曲线。校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。
（6）计算
土壤微生物生物量氮：BN = EN / kEN
式中：EN = 熏蒸土壤浸提测定的全氮 – 不熏蒸土壤浸提测定的全氮；kEC为转换系数，取值0.45。
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