土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比法）
一、原理
测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α-或者β-萘酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比法。 二、试剂
1）缓冲液：
川滇（1）醋酸盐缓冲液（PH 5.0）
0.2mol/L 醋酸溶液： 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L. 赫冀成
0.2mol/L 醋酸钠溶液： 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.
取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L.矛盾分析法
（2）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.0）
0.1mol/L 柠檬酸溶液：19.2g C6H太子乐金1007O8溶至1L.
0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.
取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.
（3）硼酸盐缓冲液（PH 9.6）
0.05mol/L 硼砂溶液： 19.05g 硼砂溶至1L.
0.2mol/L NaOH溶液： 8g NaOH溶至1L.
取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml.
2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制：酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液）
3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕瓶中，存放在冰箱里。保存的黄溶液未变褐之前均可使用。
4）甲苯
5）0.3%硫酸铝溶液（3g硫酸铝定容到1000ml）
酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕瓶中。
酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。
标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸盐缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显后稀释至刻度，30min后，在分光光度计上660nm处比。以显液中酚浓度（0、0.0002、0.0006 、0.001、0.0014、0. 0018、0.0022、0.0026 mg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
三、操作步骤
（1）称2~5g土样置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min后，
莱镇香格里（2）加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。
水三相点瓶（3）然后在培养液加入100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显。
（4）用硼酸盐缓冲液时，呈现蓝，于分光光度计上660nm处比。
注意事项:
1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样
四、结果计算
磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示：
酚（mg）=a ×8
式中，a——从标准曲线上查得的酚毫克数； 8——换算成1g土的系数
以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。
磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
V为显液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重
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