北足中医药 2021 年 4 月第 40 卷第 4 期Beijing Journal of Tra(丨itional Chinese Medicine，April，202丨，Vol. 40，No. 4•425 •
基于网络药理学的“土茯苓-金银花”药对
类风湿关节炎作用机制研究
李露1曹晔文2王欣妍2许涛2杨越1曹炜1
(1•屮闽中闵科学院广安门医院风湿科，北京100053; 2.北京中疾药大学，北京1〇〇〇29>
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81673952)
通信作者：曹讳，E-mail: *************************
【摘要】目的运用网络药理学方法筛选“土茯苓-金银花”药对类风湿关节炎（RA)的有效成分和作用靶点，探究其主要成分-核心粑点-疾病的复杂网络关系。方法通过中药系统药理学平台（TCM SP)收集“土茯苓-金银 花”药对的活性成分及作用耙点；通过GeneCards及OMIM、Drugbank数据库收集R A的疾病相关基因，构建“核心 成分-核心耙点-核心通路”网络并筛选出“土茯苓-金银花”药对R A的核心靶点，然后进一步行蛋白互作网络分析（P P I)、G O生物功能注释、KEGG通路富集分析。结果①在TCM SP数据库初步提取土茯苓化学成分75种，金银花化学成分240种，经ADME筛选后共获得土茯苓15种，金银花23种活性成分，包括紫杉酚、槲皮素、山萘 酚、香茅醇、豆甾醇等。土茯苓主要成分作用靶点基因252个，金银花主要成分作用钯点基因352个。②在据库、0M IM的两个数据库、Drugbank数据库检索得到671个R A粑点。③土茯苓、金银花与R A的共同 耙点基因55个。P P I网络分析发现JUN、AKT1、IL-10、VEGFA、T N F等可能是“土茯苓-金银花”药对R A的 关键靶点。④在DAVID数据库提交基因序列，得到富集分析结果KEGG Pathway 96条信号通路，“土茯苓-金银花” 药对R A主要参与的信号通路包括T N F信号通路、T oll样受体信号通路、H IF-1信号通路、N O D样受体信号通路、破骨细胞分化、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路等。G O富集分析包括生物过程（B P)355条结果，涉及 RN A聚合酶n启动子转录的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、炎症反应、对脂多糖的反应、脂多糖介导的信号通路、平滑肌细胞增殖的正调控、血管生成、细胞对脂多糖的反应、血管新生的正调控、以D N A为模板的转录正调控等；细胞成分（C C)27条结果，分子功能（M F)50条结果，主要涉及酶结合、细胞因子活性、转录因子结合、相同的蛋白质结合、蛋白质结合、序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、蛋白磷酸酶2A结合、转录激活子活性，r n a聚合酶n核心启动子近端区域序列特异性结合、肿瘤坏死因子受体结合等。结论“土茯苓-金银花”药对的主要活性成分通过T N F信号通路、T oll样受体信号通路、H丨F-1信号通路、NOD样受体信号通路、破骨细胞分化、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路等信号通过参与R A发病的炎症反应，从而发挥了缓解R A病情的临床作用。本研究初步探究了“土茯苓-金银花”药对R A的作用靶点和作用通路，为进一步更深人地挖掘其RA 的作用机制奠定了基础。 【关键词】网络药理学；土茯苓-金银花药对；RA；机制
D O I：10. 16025/j. 1674-1307.2021.04.027
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA)是一■种以关节滑膜炎及血管翳形成为基本病理改变并 累及全身多脏器的自身免疫性疾病，病情迁延难 愈，逐渐出现关节软骨及骨破坏，最终导致关节 畸形及功能丧失，流行病学调查显示，RA的全 球发病率为0.5 %~1%，男女患病比率约为 1:4[|]。西药的应用虽然可以在一定程度缓解RA 病情进展，但其对肝肾的毒副作用较大[2]。中医 药RA具有特殊优势，在缓解RA病情的同时可减少抗风湿药所导致的肝肾损伤[3]。“土茯 苓-金银花”药对是中国中医科学院广安门医院 风湿科R A的经验方“清热活血方”中的君 药，针对湿热瘀阻型R A药效显著[4]，二药相伍清热解毒，共除筋骨肌肉之风湿热邪，但其潜在 机制仍不清楚。本研究旨在通过网络药理学的方 法，筛选土茯苓、金银花R A的有效成分及 其作用靶点和信号通路，探究其的作用靶点 及机制，为“土茯苓-金银花”药对R A 的临
•426.北京中民药 2021 年 4 月第 40 卷第 4 期Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，April，2021，Vol. 40，No. 4
床研究提供新的理论依据。
1方法
丨.1“土茯苓-金银花”药对的活性成分与作用靶
点筛选
通过中药系统药理学数据与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TC MSP)分别输入关 键词“土茯苓”和“金银花”2味中药的化学组 成成分，根据ADME属性值进行活性成分筛选以 获得活性化合物及其作用的蛋内质靶点。选择口 服生物利用度（oral bioavailability，0B)>30 %且类 药性（drug-likeness，DL) >0. 182 个条件，筛选得 到Ingredients及 Related Targets，统一•在Uniprot 蛋白质数据库将化合物作用的蛋白质靶点进行规范，转化为基因Symbol。
1.2 类风湿关节炎相关靶点筛选
以“Rheumatoid Arthritis”为关键词，在OMIM-Gene-Map、OMIM-Entry、GeneCards、Drugbank 数据库中寻R A的潜在靶点[5]。GeneCards数据 库中，Score值越高，代表该靶点与疾病联系密切。最后综合4个数据库的结果，去除重复值得到RA 相关耙点。
1.3 “土茯苓-金银花”药对与R A靶点蛋白互作 网络分析（PPI)网络构建
利用R语言将二者靶点取交集并绘制韦恩图。进而将交集靶点提交到STRING11.0数据库构建蛋 白互
相作用的网络模型即PP丨网络模型[6]，将生物 种类设定为“human sapiens”，最小互相作用置信 度设定为 “highest confidence”（>0•95)，其余设 置均为默认设置，得到PPI网络，并通过分析其参 与的生物学进程对其功能进行描述。
1.4 “土茯苓-金银花”药对与R A靶点功能与通 路的富集分析
将“土茯苓-金银花”R A的靶点录入 DAVID数据平台，设置P<0.01，分析其主要的生 物学过程与代谢通路并进行富集分析，保存数据 结果并在Bioinformatics平台对数据进行GO功能富 集分析和KEGG通路富集分析，将数据进行可 视化。
1.5 “土茯苓-金银花”药对的核心成分-核心靶 点-核心通路网络图的构建
将药对与疾病的核心成分-核心靶点、核心通 路-核心靶点整理成Network文件和Type文件，上传到Cytoscape 3.6. 1，构建核心成分-核心钯点-核 心通路网络图，分析核心成分-核心粑点-核心通路 的网络拓扑参数。
2结果
2.1 “土茯苓-金银花”药对相关靶点的获取
在TCMSP数据库初步提取土茯苓化学成分75 种，金银花化学成分240种，经ADME筛选后共 获得土茯苓15种，金银花23种活性成分，包括紫 杉酚、槲皮素、酚、香茅醇、豆留醇等。土茯苓主要成分作用靶点基因252个，金银花主要成 分作用靶点基因352个。
2.2 R A相关异常靶点的获取
在GeneCards数据库中，Score值越高，代表 该靶点与疾病联系密切，通过输人关键词“Rheumatoid Arthritis”，得到 4 330 个结果，设定 Score大于中位数7.73，得到534个异常靶点。在0M IM的2个数据库中输人关键词“Rheumatoid Arthritis”，得到 130 个祀点，在 Dmgbank数据库中检索到62个相关靶点。最后 合并4个数据库靶点后，删除重复值得到671个RA异常靶点。
2.3 “土茯苓-金锒花”药对与RA靶点的PP丨网络构建
将筛选的“土茯苓-金银花”药对的活性成分 靶点与RA疾病靶点取交集，通过绘图软件VENN 在线绘图网站（ulouse.inra_fr/app/ example,html)55个共同粑点基因。见图1。选取 “土茯苓-金银花-RA”三者的共同靶点基因，导人 STRING11.0平台，设置蛋白种类为“homo sapiens”，获得“土茯苓-金银花-RA”蛋白互作的 PPI网络。见图2。
土茯苓金银花
图1“土茯苓-金银花”药对与R A 的粑点韦恩图
j 匕京中医药 2021 年 4 月第 40 卷第 4 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine, April ,2021 , Vol. 40,No. 4.427 •
图2药物-疾病蛋白互作P P I 网络模型
2.4靶点功能与通路的富集分析
应用DAVID 数据平台对“土茯苓-金银花”药 对R A 相关靶点进行信号通路分析，使用 Bioinformatic 平台对结果进行可视化处理。
使用在线工具DAVID 数据提交基因，计算富 集，得到富集分析结果KEGG Pathway 96条信号通 路，根据P 值<〇.〇1，FDR 值<0.05作为筛选条
件，从小到大排列，选取前20条通路进行KEGG 分析，“土茯苓-金银花”药对RA 主要参与的 信号通路包括TNF 信号通路、Toll 样受体信号通 路、HIF -1信号通路、NOD 样受体信号通路、破骨 细胞分化、雌激素信号通路、T 细胞受体信号通路 等。见图3。GO 富集分析包括生物过程（biological process , BP ) 355 条结果，细胞成分（cellular component ，CC ) 27 条结果，分子功能（molecular function , MF )50条结果，根据FDR 值<0• O 5从小 到大排列，均选取前10条进行富集分析。见图4, 耙点通路富集结果见表1。
African trypanosomiasis
Malaria
Bladder cancer
TNF signaling pathway
雷电防护技术NOD-like receptor signaling pathway
Leishmaniasis Rheumatoid arthritis
Chagas disease(American trypanosomiasis)
Inflammatory bowel disease(IBD) Toll-like receptor signaling pathway
Pertussis
HIF-1 signaling pathway
Salmonella infection Estrogen signaling pathway
Toxoplasmosis
T cell receptor signaling pathway
Hepatitis B
Osteoclast differentiation
Influenza A
Pathways in cancer
图3 KEGG 富集气泡图
Biological process C cllular component
M olecular function
降水设备
图4 G O 富集分析
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.428 •北京中医药 2021 年 4 月第 40 卷第 4 期Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine, April ,2021 ,Vol. 40,N〇.4
表1“ 土茯苓-金银花”药对RA靶点通路富集结果
GO Description Count FDR Hits
hsa04668TNF signaling pathway18 3. 75641E-16ICAM1, IL6, TNF, CCL2, PTGS2, MMP9, CXCL2, NFKBIA,
MMP3, CXCL10, AKT1 , VCAM1 , MAPK1 , FOS, JUN, CASP8,
IL IB’SELE
hsa05142Chagas disease( American
trypanosomiasis)159. 55902E-12IL6,TN F, CCL2, C X C I^, NFKBIA, IL10, AKT1, MAPK1 , FOS,
JUN, IFNG, SERPINE1 , CASP8 , IL1 B, 112
hsa05323Rheumatoid arthritis138. 80973E-10ICA M1,IL6, TNF, CCL2, CXCL8, MMP3, MMP1, FOS, JUN,
IFNG，VEGFA，IL1B, ILIA
hsa05144Malaria11 1.28068 E-09VCAM1, ICAM1, II j6, TNF, CCL2, CD40LG, IFNG, CXCL8,
IL1B,SELE,IL10
hsa04620Toll-like receptor
signaling pathway 138. 60256E-09AKT1 , MAPK1 , FOS, IL6, TNF, JU N, CASP8, CXCL8, NFKBIA,
IIJB,STAT1 ,SPP1 ,CXCL10
hsa05200Pathways in cancer20 1. 12205E-08EGFR, AR, IL6, PTGS2, MMP9, PPARG, TP53, CXCL8,
NFKBIA,STAT1 , MMP2, MMP1 , AKT1, MAPK1 , FOS, HIF1 A,
JUN, BCL2, CASP8, VEGFA
hsa05140Leishmaniasis11 6. 39931E-08M APK1 , FOS, TNF, PTGS2, JU N, IFNG, NFKBI A, IL1B, ST A T I,
IL10,IL1A
hsa05164Influenza A14 2. 11166E-07ICAM1 , IL6, TNF, CCL2, NFKBIA, CXCL8, STAT1 , CXCL10,
北京市人口与计划生育条例修正案
AKT1 ,MAPK1 ,JU N,IFN G,IL1B,ILIA
hsa05161Hepatitis B13 3. 6078 E-€7AKT1 , MAPK1 , FOS, IL6, TNF, JUN, BCL2, MMP9, CASP8,
TP53, CXCL8 , NFKBIA, STAT1
hsa04066HIF-1 signaling pathway11 1. 36786 E-06AKT1 , EG FR, MAPK1 , IL6, HIF1 A, HMOX1, BCL2, VEGFA,
电脑知识与技术SERFINE1 ,IFNG,NOS3
hsa05143African trypanosomiasis8 3. 11099E-06VCAM1 ,ICAM1 ,II^,T N F,IF N G,IL1B,SE L E,IL10
hsa05145Toxoplasmosis11 5. 27658E-06AKT1 , MAPK1 , TNF, CD40LG, BCL2, CASP8, IFNG, NFKBIA,
ALOX5,STATl ,IL10
hsa04621NOD-like receptor
signaling pathway 9 5. 74609E-06MAPK1 , IL6, TNF, CCL2, CASP8, CXCL2, CXCL8,
NFKBIA, IL1B
hsa05219Bladder cancer8 1. 56675 E-05EGFR, MAPK1 , MMP9, VEGFA, TP53, CXCI.8, MMP2, MMP1
hsa05321Inflammatory bowel disease
(_
9 1.71385E-0511,6, TNF J U N, IFNG, IL1 B, STAT1 , IL10, IL1A, IL2
hsa04380Osteoclast differentiation11 2. 89967E-05AKT1 , MAPK1 , FOS, TN F, JU N, PPARG, IFNG, NFKBIA , IL1 B,ospf
STAT1 ,IL1A
hsa04915Estrogen signaling pathway10 3.41967E-05OPRM1, AKT1, EGFR, MAPK1 , FOS, JUN, MMP9, ESR1,
NOS3, MMP2
hsa04660T cell receptor signaling pathway10 3. 73756E-05AKT1, MAPK1, FOS, TNF, CD40LG, JUN, IFNG, NFKBIA,
IL10,IL2
hsa05133Pertussis9 6. 15124E-05MAPK1 , FOS, IL j6 , TN F, JU N, CXCL8, IL1 B, IL10, IL1A
hsa05132Salmonella infection90.000137652M APK1 , FOS, IL6, JU N, CXCL2, IFNG,CXCI.8 , IL1B, IL1 A
北京中医药 2021 年4 月第 40 卷第 4 期Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine, April,2021 ,Vol. 40,N〇. 4•429*
2.5 “土茯苓-金银花”核心成分-RA核心靶点-
核心通路网络图的构建
运用Cytoscape3.6. 1构建“土茯等-金银花”核心成分-R A核心靶点-核心通路网络。根据 Count值大于平均值筛选化合物的核心成分主要 有6种，包括p-谷固醇（beta-sitosterol)、豆甾醇 (Stigmasterol)、槲皮素（quercetin)、酣(kaempferol)、木犀草素（luteolin)、柚皮苷(naringenin)。药物-疾病核心耙点根据VENN在线工具共得到55个核心靶点。根据Count值和 FDR值，筛选前20条信号通路为核心通路，包 括TNF信号通路、T oll样受体信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、破骨细胞分 化、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路等。
3讨论
RA属中医学“抵痹”“历节”“痹症”之范 畴;7]。《黄帝内经素问》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛 痹，湿气胜者为着痹。”RA病情迁延难愈，风寒 湿邪入络成瘀，久病化热，最终导致RA患者关节 湿热胶着、瘀血留滞、关节红肿热痛、屈伸不利。笔者团队认为RA活动期以湿、热、瘀为主要侵袭 因素，脾胃失调为其内在因素，根据RA活动期湿 热瘀阻的病机，提出了清热利湿活血法，以土茯 苓、金银花为君药，在中起到重要作用。林 雪[8]通过对RA患者进行辨证分型，发现湿热痹阻 证型占据最高比例，其免疫球蛋白IgG、IgA值均 高于正常值，RF、CCP、AKA、A PF阳性率均较 高。李巧〜收集166例RA患者，发现湿热痹阻型 RA患者的RF、CRP、ESR升高最明显。李德平 等[1°]通过对中国中医科学院广安门医院活动 期RA患者314首处方分析发现，土茯苓、金银花 的用药频率均>50 %。
从PPI网络图分析可知，“土茯苓-金银花”药 对的活性成分靶点与RA疾病靶点有55个共同靶 位基因，主要包括丨L-10、MMP1、M M P2、M M P3、M M P9、TNF、STAT1、VEGFA等，选取“土茯苓- 金银花-RA”的共同耙点基因，导人STRING 11.0 平台，获得“土茯苓-金银花-RA”蛋白互作的PPI 网络。其中IL-10与TNF、IL>6的关联较大，VEGFA与HIF1A、N0S3的关联度较大，TNF与PPARG、CD40LG、F0S等关联度较大；Degree 大 于平均值的基因有PTGS、AKT1、JUN、BCL2、TNF等。说明复合物“土茯苓-金银花”可能是通 过作用在PTGS、PGR、AKT1、JUN等靶点发挥治 疗RA的作用。
PTGS被称为前列腺素-过氧化物合 酶，是前列腺素生物合成中的关键酶，与炎症和 有丝分裂的前列腺素类生物合成有关[11];AKT1是 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1,AKT2和AKT3) 之一，调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和 血管生成等许多过程[12]。说明“土茯苓-金银花”可能是通过55个共同耙位基因发挥抑制R A滑膜 炎症，调节免疫平衡的作用。
从KEGG Pathway和GO富集分析图可知，“土 茯苓-金银花”药对R A可能是通过TNF信号 通路、Tol]样受体信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、破骨细胞分化、雌激素信 号通路、T细胞受体信号通路参与RNA聚合酶II 启动子转录、炎症反应、平滑肌细胞增殖、血管 新生等生物学过程。其中T细胞异常是RA发病的 主要因素，T细胞受体信号通路包含Th/Treg通 路，Thl7细胞可以产生大量致炎细胞因子，例如 IL-17A和IL-17F1131;Treg细胞分泌抑制性细胞因 子，如IL-10、IL4、TGF-p，与TN F共同作用参 与免疫稳态的调节[14]。TNF是一种促炎细胞因子，抑制TNF信号通路是最有效的抗RA方法[15]。从“药物-成分-疾病-耙点”网络图分析可知，“土茯苓-金银花”药对的核心成分有6种，包括p-谷 固醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚、木犀草素、柚 皮苷，P-谷固醇影响脂蛋白固醇和植物固醇的稳定 性，导致组织内固醇的积累，从而引发炎性反 应[16]；豆甾醇显著降低结肠组织炎症因子丨L-l p、IL*6、MCP-1和环氧合酶C0X-2的mRNA表达，抑制结肠炎症，与炎性反应联系密切[~。槲皮素 可显著改善低钙高镁饮食大鼠血清矿量和骨代谢 水平，在骨质疏松症的预防中起到重要作用[18]；山萘酚通过调节Ca2+代谢平衡，促进骨胶原生成，减少骨小梁丟失，对骨质疏松具有
作用[19]；木犀草素能抑制T细胞NF-K B信号通路，从而达 到抑制免疫的作用％；柚皮苷可以调节软骨细胞 基质和炎性微环境，促进软骨细胞C o in、Sox9、Aggrecan的表达，并抑制MMP-13，进而逆转IL-1P诱导的软骨细胞炎性退变[2U,6种成分可能分 别通过与TNF信号通路、Toll样受体信号通路、T 细胞受体信号通路等作用在其核心靶点发挥抑制 炎症反应、滑膜血管新生等作用。
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