本技术涉及一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法，所述的方法包括：⑴提取过程：取红花药材，用乙醇提取，醇提液进行浓缩干燥，加入酸水水解，水解液回收溶剂并浓缩，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，用硅胶柱分离，再用葡聚糖凝胶LH-20柱纯化，即得。本技术所述的提取、分离和检测方法具有简单可行、科学等特点。 技术要求
1.一种提取、分离红花药材中活性成分的方法，其特征在于，所述的方法按如下步骤操经济新常态的要求
作：
⑴提取过程：取红花药材，用乙醇提取，醇提液进行浓缩干燥，加入酸水水解，水解液
回收溶剂并浓缩后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，用硅胶柱分离，再用葡聚糖凝胶LH-20柱
纯化，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法进一步的操作步骤如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为6-10倍量、浓度为95%的乙醇提取2-3
次，每次1-2h，合并，醇提液浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入
体积比为2～5:1的盐酸溶液加热水解1-2h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，再
用与混悬液体积比为1:1～3的乙酸乙酯萃取2-3次，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，
装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集比例是80:20～75:25的洗
脱液并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，以体积比为
70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏后，再上葡聚糖凝胶LH-20
柱，先用甲醇洗脱，再以氯仿-甲醇液洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，
即得。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法进一步的操作步骤如下：
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⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为8倍量、浓度为95%的乙醇提取2次，
每次1.5h，合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，
加入体积比为3:1的盐酸溶液加热水解1h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与
混悬液体积比为1:2的乙酸乙酯萃取2次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，
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装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，
并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，以体积比为70:1
的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用
甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏
粉，即得。微型燃气轮机
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，按照所述的步骤得到的活性成分是化
合物6-甲氧基酚，其化学结构如下：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于最终得到的化合物6-甲氧基酚的纯度大于
98.5%。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述红花药材的检测方法如下：
⑴谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18谱柱，以体积比45:55的甲醇-0.4%磷酸溶液
为流动相，流速1.0ml/min，检测波长：367nm；
⑵对照品溶液制备：取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含9μg的溶液，
即得；
⑶供试品溶液的制备：取红花药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置平底烧瓶中，加盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热水解30min，冷却，转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
⑷测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按照步骤⑴中所述的谱
条件测定化合物素和6-甲氧基酚的含量。
说明书
一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法
技术领域
本技术涉及一种红花药材中活性成分的提取、分离及其检测方法。
背景技术
红花为菊科植物红花Cartkamus tinctorius L.的干燥花，夏季花由黄变红时进行采摘，
阴干或晒干。性温，味辛，具有活血通经、散瘀止痛的功能，主要用于经闭、痛经、恶露不
行、癥瘕痞块、跌打损伤、疮疡肿痛等症。国内外学者们对红花的化学成分及药理作用进行了较为深入的研究，具体内容如下：
A：化成成分研究：
⑴.查耳酮类：主要为红花黄素(safflor yellow,SY)，它是含有多种成分的水溶性
混合物。Takahash iY等于1982年分离得到红花黄素A(SY-A)；1984年进一步分离得到红花黄素B(SY-B)；Danisova等分离得到SY-C.Meselhy等1993年首次分离得到羟基红花黄素A(hydroxysa fflor yellow A,HSYA)。Yin HB等首次得到红花苷Cartormin，红花苷(Carthamin)是红花中的一种素，由于红花苷具某些独特的化学性质和光学特征，多年来其结构一改再改，比较混乱。
⑵.黄酮类：主要含有6-羟基山萘酚、山萘酚-3-葡萄糖苷、6-羟基酚-3-0-葡萄糖苷、
6-羟基酚-7-0-葡萄糖苷、酚、槲皮素、6-羟基-酚、黄芩苷、槲皮素苷、酚-3-芸香糖苷和芦丁、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-6-葡萄糖苷、杨梅素及芹黄素，木樨草素，木樨草素-7-0-β-D-葡萄糖苷、丁香脂素等。
⑶.脂肪酸类：有棕榈酸、二棕榈酸、肉豆蔻酸、香豆酸、月桂酸、油酸、亚油酸。
⑷.甾体类：红花甲醇提取物中分离出了3种饱和甾醇,9种5-甾醇,1种9β、19-环甾醇
和7种7-甾醇,15α,20β-二羟基-4-孕烯-3酮等，研究还发现含有β-谷甾醇、豆甾醇。
⑸.多糖类：该成分是由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和中乳糖以β-键连接的一种多糖体。
⑹.聚炔类：主要为3(顺),11(反)-和3(反)-十三碳-1,3,11-三烯-5,7,9-三炔、二十九烷、
β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷、十六烷酸甘油酯、反-3-十三烯-5,7,9,11-四炔-1,2-双醇和反-
反-3,11-十三烯-5,7,9-三炔-1,2-双醇等。
⑺.微量元素：红花花中含钾、钠、氯等大量元素，还富含铬、锰、锌、钼等微量元素。
⑻.其它：红花中含benzy l-0-β-D-glucopyra-noside、5-羟甲基糠醛、胡萝卜苷等。
B.药理活性:
⑴对心功能及血管的影响：小剂量红花煎剂对蟾蜍心脏有轻微兴奋作用，使心跳有力、振
幅加大，对心肌缺血有益；大剂量对蟾蜍反而有抑制作用，而扩张体冠动脉及股动脉。研究
表明红花黄素可减少大鼠低灌流离体心脏乳酸脱氢酶(LDH)漏出，缓解心室肌组织ATP含量下降及其超微结构的损伤；又可缓解大鼠心肌线粒体混悬液中线粒体的肿胀及膜流动性下降，即缓解大鼠心肌缺氧性损伤，改善心肌能量代谢，腹腔注射红花黄素可明显降低大鼠心率，且显著改善异丙基肾上腺素(ISOP)所致的心电图缺血性改变；同时可缓解大鼠低灌流离体心 脏的心率及冠状动脉流量的下降。红花黄素对大鼠缺血再灌注损伤心肌的影响实验表明，
红花黄素能影响心肌蛋白的表达，对心肌缺血再灌注有一定保护作用。红花黄素在缺氧复
氧条件下对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素(Ps)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因表达的影响
实验表明，单纯缺氧状态下大鼠肺动脉血管内皮细胞Ps、ICAM-1表达无明显变化，缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1表达上调，红花黄素可抑制缺氧负氧条件下Ps、ICAM-1的过度表达。
⑵降血压、降血脂作用：研究表明红花黄素对自发性高血压大鼠有明显降压作用，大
鼠灌服红花黄素后血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ均有明显下降，并能够显著降低冠心病心
绞痛患者的胆固醇和甘油三酯。
⑶抗凝血、抑制血栓形成的作用：研究表明红花黄素A通过抑制PAF所致血小板黏附、
释放及血小板内游离Ca2+浓度升高而使血小板活化受到抑制，缓解了血栓形成、炎症反应等病理变化，减轻了血液循环障碍。羟基红花黄素A抗凝作用的研究表明HSYA可抑制ADP诱发的家兔血小板聚集，延长PT及RT，提示该成分为红花抗血栓有效成分，可阻断多种途径诱发的血栓形成反应。
⑷对神经系统的作用：红花黄素A对大鼠缺血脑细胞线粒体的损伤有明显的保护作用，
表现为抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、膜磷脂降解、线粒体肿胀、NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和细胞素c氧化酶活性的降低，改善线粒体呼吸功能；同时羟基红花黄素A能明显降低脑缺血大鼠脑线粒体丙二醛(MDA)含量、升高超氧化物歧化酶(SOD)活性、抑制Ca2+过多摄入。
边缘父子
⑸抗自由基、抗氧化、抗衰老作用：红花黄素可清除羟自由基、抑制脂质过氧化、保
护细胞膜，其主要成分羟基红花黄素A为一查耳酮类成分，其分子中含有多个酚羟基。红花水提液有抗氧化作用，可清除羟自由基及抑制脂质过氧化反应，可显著延长中老龄鼠游泳时
间及常压缺氧和寒冷条件下存活时间，增强小鼠在各种不利环境中的生存能力并显著抑制中
老龄大鼠体内过氧化质生成，具有抗衰老作用。
⑹抗炎、免疫抑制作用、兴奋子宫作用、抗肿瘤等作用。
目前，本权利人独家生产的丹红注射液是由丹参、红花2味药材制成的中药注射剂，具
有活血化瘀，通脉舒络之功效，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症；冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓；为深受上述疾病折磨的广大患者带来了非常显著的效果。其中红花药材是该成方制剂的主要组成药味，本申请人对购得的红花原料药，通过对不同批次、不同产地的红花药材进行分析，发现均有一个未知成分对红花药材中的指标成分山柰素的含量检测存在干扰，为了解决这一技术问题，从而保证红花药材的质量控制，其最终保证丹红注射液的疗效和用药安全。据此，我们对红花药材中该未知部位进行分离、纯化及结构解析和药效评价等方面的研究。
技术内容
本技术的目的之一在于提供一种红花药材中活性成分的提取、分离方法；
本技术的目的之二在于解析所提取的活性物质的化学结构；
本技术的目的之三在于提供红花药材中该活性物质的检测方法。
本技术所述的红花中活性成分的提取、分离方法，它是由如下步骤操作：
⑴提取过程：取红花药材，用乙醇提取，醇提液进行浓缩干燥，加入酸水水解，水解液
回收溶剂并浓缩，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，用硅胶柱分离，再用葡聚糖凝胶LH-20柱
纯化，即得。
进一步来说，所述方法的技术方案操作如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为6-10倍量、浓度为95%的乙醇提取2-3
次，每次1-2h，合并，醇提液浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入
体积比为2～5:1的盐酸溶液加热水解1-2h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，再
用与混悬液体积比为1:1～3的乙酸乙酯萃取2-3次，萃取液浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，
装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集比例是80:20～75:25的洗
脱液并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1～2混合，以体积比为70:1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏后，再上葡聚糖凝胶LH-20 柱，先用甲醇洗脱，再以氯仿-甲醇液洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
进一步，所述方法较优的技术方案如下：
⑴提取过程：取红花药材，用与红花药材重量比为8倍量、浓度为95%的乙醇提取2次，
每次1.5h，合并，醇提液于45℃减压浓缩干燥成浸膏，用60℃、浓度为95%乙醇进行溶解后，加入体积比为3:1的盐酸溶液加热水解1h，水解液进行减压浓缩至无醇味，以水混悬，用与
混悬液体积比为1:2的乙酸乙酯萃取2次，萃取液于65℃减压浓缩、干燥成浸膏，留用；
⑵分离、纯化过程：取步骤⑴中留用的浸膏，与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，
装柱，以体积比为100:0～70:20的石油醚-丙酮进行洗脱，并收集85:15～75:25的洗脱液，
并浓缩、干燥成浸膏，再将浸膏与100-200目硅胶按重量比为1:1.5混合，以体积比为70:1
的氯仿-甲醇进行洗脱，收集该洗脱液并浓缩、干燥成浸膏，再上葡聚糖凝胶LH-20柱，先用甲醇洗脱，再以体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，收集、合并洗脱液，浓缩干燥并粉碎成干膏粉，即得。
上述3个提取方法中，所述盐酸溶液的配制方法是：取15体积份的盐酸加水至37体积
份。
以上所有的技术方案中所提取、分离的组分为黄粉末，最终结合1HNMR和13CNMR确定此化合物为黄酮类化合物，其化学结构为6-甲氧基酚，结构式如下：
偶极子天线
（具体测定数据见表1），并且所得到的6-甲氧基酚的纯度应大于98.5%。
表11HNMR和13CNMR实验数据
本技术技术方案中还提供了对红花药材中素和6-甲氧基酚检测方法，具体如下：
豫公网安备41160202000603
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