TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结
1. ⼏种细胞凋亡检测⽅法中TUNEL法的优点和缺点是什么？
2. TUNEL法的实验原理是什么？
3. TUNEL实验中⼏个关键步骤是什么？
4. 如何减弱⾮特异性染⾊？
5. 细胞通透的时间如何选择？
6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？
襄阳东站无头女尸
8. DAB的显⾊时间和条件如何把握？
9. ⾸次做TUNEL实验的注意事项？
10. PBS浸洗在TUNEL法中的作⽤和⽅法分别是什么？
爱的流刑地
11. 脱蜡和⽔化在TUNEL法中的作⽤和⽅法分别是什么？
针对问题3（TUNEL实验中⼏个关键步骤是什么？）：
1. 充分脱蜡和⽔化。脱蜡可以先60度20min，再⽤⼆甲苯两次5~10min；⽽⽔化⽤梯度⼄醇从⾼浓度到低浓度浸洗，这些以便后⾯的结合反应充分、均匀；
2. 把握好细胞通透的时间。⼀般根据切⽚的厚薄，选择蛋⽩酶k的孵育时间，常⽤10~30min，⼏um切⽚⽤短时间；⼏⼗um切⽚⽤长时间，通过摸索达到既不脱⽚，有能够使后⾯的酶和抗体进⼊胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。⼀般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选
择更长的时间，可长⾄2h，但要结合你最终的背景着⾊。
4. DAB显⾊条件的选择。⼀般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜⾊，最长不超过30min；我不喜欢⽤promega公司提供的DAB液（桃红⾊），不利于辨认棕褐⾊。
5.PBS的充分清洗。我个⼈认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应⼗分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切⽚的⾮特异性着⾊。
6. 此外，内源性POD的封闭也⼗分关键。对于肝脏、肾脏等⾎细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升⾼过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染⾊。 针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：
男生女生金版txt基本原理：对不同组织切⽚先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进⼊细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再⽤HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素⾄少可以再结合3个biotin分⼦），最后⽤DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发⽣氧化、环化反应，形成苯⼄肼聚合物⽽呈现棕褐⾊，最终通过计数每张切⽚上不同视野中TUNEL阳性细胞的⽐例来判断细胞凋亡发⽣情况。
TUNEL⽅法检测凋亡的讨论
TUNEL⽅法检测凋亡的原理
ljksbs ：细胞凋亡中, 染⾊体DNA双链断裂或单链断裂⽽产⽣⼤量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作⽤下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物
酶、碱性磷酸酶或⽣物素形成的衍⽣物标记到DNA的3'-末端，从⽽可进⾏凋亡细胞的检测，这类⽅法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺⼝末端标记法（terminal -deoxynucleoti dyl transferase med
iated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA的断裂，因⽽没有3'-OH形成，很少能够被染⾊。TUNEL实际上是分⼦⽣物学与形态学相结合的研究⽅法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡⼩体进⾏原位染⾊，能准确地反应细胞凋亡典型的⽣物化学和形态特征，可⽤于⽯蜡包埋组织切⽚、冰冻组织切⽚、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因⽽在细胞凋亡的研究中被⼴泛采⽤.
TUNEL细胞凋亡详细流程
youngtiger：
TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒
细胞发⽣凋亡以后，出现多个⽣物学改变特征，如：细胞膜、染⾊质凝集、核DNA断裂等等。⽬前DNA断裂检测是⼀种⼴为认可的检测凋亡的⽅法，这种检测可以通过提取细胞DNA进⾏凝胶电泳来完成，也可以进⾏原位检测，即常说的
TUNEL（TdT介导的dUT P缺⼝末端标记技术）⽅法。
TUNEL⽅法的基本原理如下：在TdT酶的作⽤下，将⽣物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3'OH上，然后加⼊酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体，达到原位检测⽬的。
试剂盒简单操作步骤：
细胞或组织⽚固定（中性固定液，如3.7％甲醛）
⽔化（样本依次在100%、95%、70%的⼄醇处理）
PBS浸泡
蛋⽩酶K处理标本（蛋⽩酶K主要应⽤于组织样本和对照⽚，Cytonin⽤于新鲜准备的细胞样本）
双蒸⽔（dH2O）洗涤
加里曼丹3%H2O2甲醇溶液（Quenching solution）消除内源性HRP
PBS中洗涤
1XTdT标记缓冲液孵育
TdT标记Biotin-dNTP（TdT标记反应混合物）
终⽌标记反应（1XTdT Stop Buffer）
PBS洗涤
Streptavidin-HRP孵育（若使⽤荧光标记的Streptavidin，则⽆需进⾏以下步骤，直接在荧光显微镜下观察）
PBS洗涤
DAB溶液显⾊
去离⼦⽔中洗涤
甲基绿溶液复染
使⽤TUNEL试剂盒基本注意事项：
避免将试剂盒保存于⽆霜冰箱中
使⽤PH中性的固定液固定组织或者细胞，避免使⽤酸性或者碱性固定液，以免出现认为DNA损伤；推荐使⽤3.7％甲醛溶液）在操作过程中避免出现⼲⽚现象
根据标本类型决定孵育时间（蛋⽩酶K、TdT等），保证最佳效果
使⽤过程避免将TdT酶置于冰上；避免反复冻溶。
使⽤试剂盒提供的⼆价阳离⼦优化标记反应（Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染⾊；建议使⽤Co2+开始反应）
按照正确的顺序准备标记混合物；最后⼀步加⼊标记缓冲液
使⽤新鲜的H2O2溶液，孵育后⽴即将标本放⼊PBS清洗（H2O2可导致DNA损伤）
liufaquan：应⽤原位DNA末端转移酶法（TUNEL）观察细胞凋亡
（1）细胞⽣长⽚原位，2%为多聚甲醛固定15min，PBS 漂洗5min×3
（2）甲醛、过氧化氢（0.03%）15min，消除内源性过氧化物酶的活性
（3）PBS漂洗5min×3，0.1%TrionX-100 4℃条件下孵育2分钟
（4）滴加DNA末端转移酶及FITC标记dUTP反应混合液50µl，37℃湿盒内孵育1
h(1号+2号)
（5）PBS漂洗5min×3，滴加HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗FITC抗体(3号)，3 7℃湿盒内保温1h.
（6）DAB暗处显⾊5min，终⽌显⾊。镜下观察、摄影。
阳性细胞为胞核呈棕黄⾊，不着⾊为阴性。同时⽤PBS代替DNA末端转移酶，作为
阴性对照。
蹭蹭族
nixiao：细胞凋亡中染⾊体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染⾊体DNA⾸先
在内源性的核酸⽔解酶的作⽤下降解为50-300kb的⼤⽚段。然后⼤约30 ﹪的染⾊体DNA 在Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作⽤下，在核⼩体单位之间被随机切断，形成180～20
0bp核⼩体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要⼀条链上出现缺⼝⽽产⽣的⼀系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作⽤下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或⽣物素形成的衍⽣物标记到DNA的3’-末端，从⽽可进⾏凋亡细胞的检测，这类⽅法⼀般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺⼝末端标记法（TUNE L）。由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA的断裂，因⽽没有3’-OH形成，很少能
够被染⾊。低分⼦量的DNA分离后，也可使⽤DNA聚合酶进⾏缺⼝翻译（nick translatio n），使低分⼦量的DNA标记或染⾊，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺⼝翻译法实际上是分⼦⽣物学与形态学相结合的研究⽅法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡⼩体进⾏原位染⾊，能准确的反应细胞凋亡最典型的
⽣物化学和形态特征，可⽤于⽯蜡包埋组织切⽚、冰冻组织切⽚、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远⽐⼀般的组织化学和⽣物化学测定法要⾼，因⽽在细胞凋亡的研究中已被⼴泛采⽤。
过氧化物酶标记测定法
原理：脱氧核糖核苷酸衍⽣物地⾼⾟[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作⽤下，可以掺⼊到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地⾼⾟抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物
酶可产⽣很强的颜⾊反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因⽽可在普通光学显微镜下进⾏观察。
⽑地黄植物是地⾼⾟的唯⼀来源。在所有动物组织中⼏乎不存在能与抗地⾼⾟杭体结合的配体，因⽽⾮特异性反应很低。抗地⾼⾟的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋⽩酶⽔解的⽅法除去后，则可完全排除细胞Fc受体⾮特异性的吸附作⽤。
本⽅法可以⽤于福尔马林固定的⽯蜡包埋的组织切⽚、冰冻切⽚和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。
(⼀)试剂配制
1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐50mM，NaCl 200mM。
2、蛋⽩酶K（200µg/ml，pH7.4）：蛋⽩酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液98.0ml。
4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱3.63g⽤0.1N HCl调节pH⾄7.2，加dd H2O定容到1000ml；再加⼊⼆甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g。
5、TdT酶反应液：TdT酶32µl；TdT酶缓冲液76µl，混匀，置于冰上备⽤。
6、洗涤与终⽌反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05％⼆氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临⽤前过滤后，加过氧化氢⾄0.02%。
8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M⼄酸钠100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％⼄醇，⼆甲苯，10％中性甲醛溶液，⼄酸，松⾹⽔
等。
10、过氧化物酶标记的抗地⾼⾟抗体（ONCOR）
（⼆）实验步骤
1、标本预处理：
（1）⽯蜡包埋的组织切⽚预处理：将组织切⽚置于染⾊缸中，⽤⼆甲苯洗两次，每次5min。⽤⽆⽔⼄醇洗两次，每次3min。⽤95％和75％⼄醇各洗⼀次，每次3min。⽤PB S洗5min 加⼊蛋⽩酶K溶液（20ug／ml），于室温⽔解15min，去除组织蛋⽩。⽤蒸馏⽔洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进⾏操作。
（2）冰冻组织切⽚预处理：将冰冻组织切⽚置10％中性甲醛中，于室温固定10min 后，去除多余液体。⽤PBS洗两次，每次5min。置⼄醇：⼄酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。⽤PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进⾏操作。
（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 ×107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻⽚上滴加50～100µl细胞悬液并使之⼲燥。⽤PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进⾏操作。
2、⾊缸中加⼊含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。⽤PBS洗两次，每次5mi n。
3、⽤滤纸⼩⼼吸去载玻⽚上组织周围的多余液体，⽴即在切⽚上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4、⽤滤纸⼩⼼吸去切⽚周围的多余液体，⽴即在切⽚上滴加54µl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应1hr（注意：阴性染⾊对照，加不含TdT酶的反应液）。
5、将切⽚置于染⾊缸中，加⼊已预热到37℃的洗涤与终⽌反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻⽚轻轻提起和放下⼀次，使液体轻微搅动。
6、组织切⽚⽤PBS洗3次，每次5min后，直接在切⽚上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地⾼⾟抗体，于湿盒中室温反应
30min。
7、⽤PBS洗4次，每次5min。
8、在组织切⽚上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显⾊3～6min。
9、⽤蒸馏⽔洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、于室温⽤甲基绿进⾏复染10min。⽤蒸馏⽔洗3次，前两次将载玻⽚提起放下10次，最后1次静置30s。依同样⽅法再⽤100％正丁醇洗三次。
11、⽤⼆甲苯脱⽔3次，每次2min，封⽚、⼲燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
（三）注意事项
⼀定要设⽴阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切⽚可使⽤DNaseI部分降解的标本，
阳性细胞对照可使⽤地塞⽶松（1µM）处理3-4hr的⼤、⼩⿏胸腺细胞或⼈外周⾎淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。
⽤流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡各有何优缺点
xiaobang1979：请教：⽤流式细胞仪检测细胞凋亡结果可靠吗？是不是还需要做TUN EL法检测证实吗？还是⼆者结合更好？midas：细胞凋亡的⾦标准是电镜。
其他⽅法如TUNEL法、流式等都是可靠的⽅法，但是最好是两种以上结合验证凋亡。
两种TUNEL检测应如何选择
hongbin9179：现在我⼿头上有两种TUNEL的⽅法（我要观察的是贴壁动物细胞），
⼀是⽤荧光素标记d-UTP,TdT介导酶反应，然后⽤AP或POD作为报告酶标记的荧
光素抗体结合已结合在DNA上的荧光素，最后⽤光线显微镜观察结果；
⼆是冷泉港细胞实验⼿册介绍的⽅法，⽤地⾼⾟标记d-UTP，酶反应结合上DNA后⽤辣根过氧化酶偶联的抗地⾼⾟结合地⾼⾟，在加⼊DAB底物和过氧化氢。
请哪位⼤侠说⼀下哪个⽅法较灵敏，⽽且除了能⽤光线显微镜观察结果外，假如要⽤娜拉走后怎样
流式细胞仪时在试剂上⽆需改动太⼤的？本⼈第⼀次做这⼀类实验，经验不⾜，请有识之⼠帮帮忙。
midas：两种⽅法灵敏性均可以，第⼀种更⽅便⼀些。
流式细胞仪检测凋亡时的试剂⼀般是：PI-hoechst，或PI-Annexin-V
liufaquan：第⼀种⽅法较好，因为荧光照⽚⽐较漂亮，容易简单。第⼆种⽅法主要地HRP的DNA染⾊，背景不好控制容易出现假阳性。
TUNEL假阳性⾼怎么办
jingr: 家兔主动脉⾎管⽯蜡切⽚，做TUNEL,DAB染⾊，有的⽚⼦阳性率竟然达到50％，不可能的。
woozson: 假阳性⾼是TUNEL检测的⼀个主要缺点。观察TUNEL阳性⽚是应对照H E切⽚。结合细胞HE染⾊来判断阳性的细胞究竟是假阳性还是真正发⽣了凋亡。凋亡细胞HE形态：细胞固缩，核染⾊质边集，但细胞膜完整，形成凋亡⼩体。
为什么我的TUNNEL做出来都是阳性
milaosul：我做了TUNNEL⽅法测凋亡，结果出来两组皆很强的阳性，与预期不⼀样，请问为什么
zmy1114：能不能把图附上，把你的实验步骤简单的描述⼀下。同时应该做⼀下空⽩对照和阳性对照，这样才能分辨你做的是真阳性还是假阳性。我们实验室⼀开始有⼈做免疫组化的时候就没有做空⽩对照，DAB显⾊后是有棕⾊颗粒，以为出来了，结果实验快做完了，补了⼀张空⽩对照，和⾃⼰的阳性结果⼀样。空⽩对照⽚就是不加⼀抗，⽽⽤PBS代替，其他步骤都⼀样。阳性对照⽚就是⼏张肯定有你这种抗体表达的组织⽚来做⼀下。再有就是你在洗涤的过程中应该时间长⼀些。
milaosul：我的图⽚实验室拍照⽚程序有点⿇烦，没有现成可以拍照⽚的地⽅.我
已经电话博⼠得公司，说这次TUNNEL加抗体标记后37度只能孵育⼀⼩时，我照着说明书处理两⼩时
中共党员：你的试剂盒可以买promage 的40⼈份2800元左右，可能效果会好⼀点。国产的，呵呵，有点不可靠
Nevin：我也正好在⽤tunel作有关apoptosis的研究，体会如下：
事实上，tunel的假阳性是很多的，因素也是很多的，如：
1) 固定液的性质和成分；2）组织块的⼤⼩和固定时间；3）AR的⽅法与你的处理时间等等
另外，⼀些有基因转录活性的⾮淍亡细胞也会呈tunel阳性。
所以，tunel检测apoptosis最好要结合形态学特征才⽐较可靠。
最后，假阳性特别要提⼀下固定液，固定液的浓度过⾼可造成组织边缘的迅速固定，从⽽影响液体的穿透，致使待固定组织的中⼼固定不佳－－－－－可以导致组织中⼼的cel l⾃溶、DNA链不规则断裂，这就能致假阳性。
关于TUNEL试剂盒
zyj12321:
E-Mail: yu.an@www.doczj/doc/2c010f19c5da50e2524d7f5b.html For Technical QuestionsOnline Questions Apoptosis Product Name：in Situ Cell Death Detection Kit, AP
Description Catalog # Pack size Price Qty Options 1684809 1 kit (50 tests)
电话021-********
In Situ Cell Death Detection Kit, AP 原位细胞凋亡(程序死亡)检测试剂盒，碱性磷酸酶
规格价格￥50~100T 5,016.00
内容介绍：
细胞死亡有两种不同的⽅式：凋亡和坏死。两者可根据死亡细胞的形态、⽣物化学改变等的不同⽽加以鉴别。程序性细胞死亡或凋亡，是真核细胞死亡最常见的形式，它是保持体内平衡的⼀种⽣理性⾃杀机制，是正常组织更新过程中⾃然发⽣的细胞死亡。⼀般说来，凋亡细胞出现胞核和胞浆结构上具有特征性的改变，包括胞浆膜的快速起泡和核裂解。核崩解与染⾊质的⼴泛损伤不伴随DNA的裂解的情况是极为少见的。凋亡在许多⽣理过程中包括免疫系统成熟和效应机制，组织、器官和四肢胚胎发育、神经系统的发育以及激素依赖的组织重塑等都是必需的。在诸如缺⾎、中风、⼼脏疾病、癌肿、AIDS、⾃⾝免疫病、中毒性肝病和中枢神经系统的退⾏性变等疾病中，凋亡的不适当的调节起着重要
的作⽤。各种抗癌药物、放射和⾼温都可以触发凋亡；肿瘤细胞对凋亡的敏感性受⼏种癌基因表达的调节；凋亡可能是癌症的⼀种预后标志，肿瘤学上所观察到的这些凋亡现象已引起⼈们⼴泛的兴趣。
已有许多⽅法可⽤来检测凋亡细胞。据认为核酸内切酶介导核溶解作⽤在细胞凋亡中是关键的⽣物化学事件，它引起核DNA
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议