2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着，但是正常细胞核的Hoechst着的形态呈圆形，淡兰，内有较深的兰颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰，或核呈分叶，碎片状，边集。 当归注射液故PI着为坏死细胞；亮兰，或核呈分叶状，边集的Hoechst着的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml的储备液，用前等量混合（注意避光）
protocol:
1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染及分析），离心，11,000rpm，5min。
2、 用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。
3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步）
4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。
5、 加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min－1h。
高温密封材料混匀。
溶液配方：PBS 910μl
PI 80μl
RNase 10μl
共1ml
6、过滤，供流式检测。
Hoechst 33342/PI双染法
紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态:
活细胞(VN) ,染成蓝,核呈正常结构;
早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝,核呈固缩状或圆珠状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红,但可见明显的染质凝集。
非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红,核呈正常结构;
贴壁细胞：
1、培养细胞中加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；
2、37℃，避光染10min，
3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，
4、4℃，避光反应10min，
5、荧光显微镜下观察，照相。
悬浮细胞：
德鲁兹1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.2
5％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/
ml，37℃孵育7～10min。
2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。
3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染15min。
4．400目的筛网过滤1次。
5．流式细胞仪分析。
另外这是活细胞染，还有固定后染的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在4度固定5min后，PBS漂洗，进行以上操作。
先染后固定：
Hoechst33258染法
1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
2．细胞固定液4℃固定5min。
3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染液，10min。
4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。
5．封片剂封片后荧光显微镜观察。
Hoechst33342染法
1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。
2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。
3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。
我国名画家张善子擅长画什么4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。
以上是先将细胞染后再行固定观察的方法，也可先固定后染：
1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。
2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。
3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。
4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。
5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。
6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。
注意事项：
1、－２０度７０％乙醇固定细胞过夜，固定后可以放在－20度冰箱，一般能保存几个月；
2、染前要用DNA抽提缓冲液（PC buffer）作用５分钟，；
3、加ＰＩ的量按照1×PI，106个细胞5ul ；
4、加RNAase是为了消化RNA，以免影响DNA分析的结果。
操作过程，不用一定强调无菌，但是干净点没错的。
一般来说都采用 用Hoechest-PI双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着浅，凋亡细胞主要摄取Hoechest染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取PI呈红荧光。
我的细胞已经做了盖玻片在六孔板里面的爬片 并且加了95%酒精固定 下一步打算做Hoechst-PI双染检测细胞凋亡 请教具体步骤 以及药物浓度
是不是这样
固定后
1.用PBS漂洗，加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；
2、37℃，避光染10min，
3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，
4、4℃，避光反应10min，
5、荧光显微镜下观察，照相。激发波长：hochest用紫外激发；PI用绿光激发
咸阳偏转集团公司荧光显微镜下观察并计数凋亡指数（apoptotic index：percentage of apoptotic cells）。每个样本随机观察4个视野进行计数。计数1000个细胞，凋亡指数＝凋亡细胞数/1000 ×100％。凋亡指数取前后2次计数的平均值。实验重复3次。郑州广电宽带客户端
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议