开滦集团矿井事故
李岩;陈德泉;叶泽波
【摘 要】针对10份不同产地的铁皮石斛,采用甲醇超声萃取,Oasis HLB固相萃取柱净化,Hypersil BDS C18谱柱分离,二极管列阵检测器测定,建立高效液相谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)同时测定13种酚酸类物质的检测方法.结果表明:在0.5 μg/mL~50.0 μg/mL范围内,具有良好的线性关系(R2≥0.9996);LOD在0.07 mg/kg~0.3 mg/kg之间;LOQ在0.2 mg/kg~1.0 mg/kg之间;加标回收率在86.7 %~102.3 %之间,RSD在1.1 %~3.5 %之间;铁皮石斛中共检出12种酚酸,阿魏酸含量最高,其次是丁香酸、二氢阿魏酰酪胺、对羟基苯甲酸,这些酚酸可能与铁皮石斛的抗氧化、增强免疫力、降血糖等功效有关,这将为铁皮石斛活性物质研究与开发提供参考.%For 10 Dendrobium officinale from different origins,the determination of 13 kinds of phenolic acids by high performance liquid chromatography(HPLC)was carried out using ultrasonic extraction with methanol, purification with Oasis HLB solid phase extraction column,Hypersil BDS C18column separation and diode array detector.Material testing methods.The results showed that there was a good linear relationship(R2≥0.999 6)in the range from 0.5 μg/mL to 50.0 μg/mL,the LOD were range from 0.07 mg/kg to 0.3 mg/kg and the LOQ were range from 0.2 mg/kg to1.0 mg/kg.The recoveries were range from 86.7 % to 102.3 %,RSD were range from 1.1 % to 3.5 %.12 kinds of phenolic acids were detected in Dendrobium officinale,and the content of ferulic acid was the highest, followed by syringic acid, dihydro ferulic acid tyramine, p-hydroxybenzoic acid, and these phenolic acids may be antioxidants, enhance immunity, hypoglycemic effect, which will provide refer-ence for the research and development of active substance of Dendrobium officinale.
【期刊名称】《食品研究与开发》
重芳烃【年(卷),期】2018(039)007
【总页数】6页(P174-179)
【关键词】HPLC;铁皮石斛;酚酸;组成;测定
【作 者】李岩;陈德泉;叶泽波
【作者单位】广东岭南职业技术学院,广东广州510663;广东岭南职业技术学院,广东广州510663;广东岭南职业技术学院,广东广州510663
【正文语种】中 文
铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属附生多年生草本植物，是传统中草药植物，具有生津养胃、滋阴清热、降血糖、增强机体免疫力等功效，富含石斛多糖、生物碱、氨基酸、类黄酮、酚酸等对人体有益的天然药物活性物质[1-2]。其中酚酸（Phenolic acids）是指结构中含有活泼氢供体的酚羟基有机酸[3-5]，主要为苯甲酸和肉桂酸的羟化衍生物，比如香草酸、丁香酸、没食子酸、香豆酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸等。研究表明酚酸具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗紫外线辐射等功效[6-8]。因此进一步探明铁皮石斛中对健康起促进功效的酚酸类物质组成及其含量具有重要意义。GYNOCLINICD妇科检查
目前酚酸的测定方法有毛细管电泳法[9]、高效液相谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、液相谱-质谱联用法（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[14-17]，研究对象主要为蔬菜[1]、水果[8]、水稻[10]等，但关于铁皮石斛中酚酸类物质组成及其含量的报道较少。本研究针对10份不同产地的铁皮石斛，
采用甲醇超声萃取，Oasis HLB固相萃取柱净化，Hypersil BDS C18谱柱分离，二极管列阵检测器测定，建立了高效液相谱法同时测定13种酚酸类物质的检测方法，该法简便、高效、灵敏、准确，可为铁皮石斛酚酸组成鉴定及质量研究提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂、材料
Agilent 1260型高效液相谱仪：美国Agilent公司；Rotavapor R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；MM400型研磨仪：德国RETSCH公司；Milli-Q Integral型超纯水机：美国Mill-pore公司；BRC-100A 30L型超声波清洗器：郑州渤锐超声波设备有限公司；BS224S型电子天平：德国Sartorius公司。
13种酚酸标准物质：没食子酸、原儿茶酸、N-p-香豆酰酪胺、松柏醇、二氢阿魏酰酪胺、丁香酸、丁香醛、香草酸、对羟基苯丙酸、对羟基桂皮酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸（纯度均大于98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，具体信息见表1。乙腈、甲醇（谱纯）：美国Fisher公司；甲酸、乙酸铵（谱纯）：美国Sigma公司；氢 氧化钠、盐酸（均为分析纯）：上海安谱科学仪器有限公司；其余试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。酚酸标准储备溶液：分别准确称取适量的酚酸标准物质，用80%甲醇溶液配制成浓度为1 000 μg/mL标准储备溶液，4℃保存。
表1 13种酚酸标准物质信息表Table 1 Information table of 13 kinds of phenolic acids序号 名称 缩写 分子式 CAS登录号 吸收波长/nm 检测波长/nm 1没食子酸 GA C7H6O5 149-91-7 270 260 2原儿茶酸 PD C7H10N2OS 2954-52-1 259、293 260 3 N-p-香豆酰酪胺 PA C17H17NO3 36417-86-4 243、323 320 4松柏醇 CA C10H12O3 458-35-5 247、321 320 5二氢阿魏酰酪胺 TFT C18H19NO4 66648-43-9 283、317 280 6丁香酸 SA C9H10O5 530-57-4 248、322 320 7丁香醛 DH C9H10O4 134-96-3 246、308 320 8香草酸 VA C8H8O4 121-34-6 260、291 260 9对羟基苯丙酸 HP C9H10O3 501-97-3 236、322 320 10 对羟基桂皮酸 HCA C9H8O3 7400-08-0 255、364 260 11 阿魏酸 FA C10H10O4 25429-38-3 235、321 320 12 对羟基苯甲酸 HA C7H6O3 99-96-7 255 260 13 3-羟基肉桂酸 HDA C9H7O3 14755-02-3 276 280
10份不同产地的铁皮石斛，产地分别为安徽（大别山）、浙江（鄞县、天台、仙居）、福建（宁化）、广西（天峨）、四川（合江）、云南（石屏、文山、麻栗坡），样品经粉碎后，过200目筛，备用。
1.2 液相谱条件仪器分析论文
谱柱：HypersilBDSC18（3.0μm，4.6mm×150mm）；流动相：10 mmol/L醋酸铵溶液（A）和甲醇溶液（B）；检测波长：260、280、320 nm；柱温：40℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱条件见表2。
表2 洗脱梯度程序Table 2 The mobile phase gradient program of HPLC时间/min 10 mmol/L醋酸铵/% 甲醇/%0.0 95 5 2.0 88 12 7 88 12 12 55 45 15 20 80 15.1 95 5 21 95 5
1.3 样品前处理
准确称取2 g样品（精度至0.1mg）于100 mL离心管中，加入20 mL 80%甲醇溶液（含有1%抗坏血酸），振荡混匀后，室温下超声（300 W，40 KHz）提取30 min；加入10 mL 4
mol/L NaOH溶液，充入N2后密封，37℃恒温振荡水解2 h（200 r/min）后，加入10 mol/L HCl调节pH至2。加入20 mL乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，35℃旋转蒸发近干，用6 mL 80%甲醇溶液溶解后，Oasis HLB固相萃取柱净化，净化后经0.22 μm有机过滤头过滤，滤液供液相谱分析。
1.4 标准曲线绘制
分别移取1 000 μg/mL酚酸标准储备溶液适量置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容，配制浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的酚酸混合标准工作溶液，自动进样器进样，测定峰面积，以酚酸标准溶液质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，建立线性回归方程。科洛奇尼
2 结果与讨论针灸师
2.1 检测波长的选择
采用二极管阵列检测器对13种酚酸类物质进行紫外线扫描（190 nm～700 nm），得到13种酚酸类物质的最大紫外吸收光波长。为了获得较大的紫外吸收峰，并减少干扰，GA、P
D、VA、HCA、HA 选择 260 nm 作为检测波长，紫外吸收较大，且干扰较小；TFT和HAD选择280 nm作为检测波长，紫外吸收较大，无杂峰干扰；PA、CA、SA、DH、HP、FA 选择 320 nm 作为检测波长。在260、280、320 nm 3种检测波长下，13种酚酸类物质可获得较好的谱分离效果，紫外吸收较大、干扰小，且基线分离（图1）。
2.2 谱柱的选择
考察了 poroshell 120 EC-C18、BEH C18、Penomenex C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C8 等不同微粒填料的谱柱对13种酚酸的分离效果（图1）。
从图1中可知：在260、280、320 nm 3种检测波长下，13种酚酸在Hypersil BDS C18谱柱上分离效果较好，峰形尖锐且对称，故选择Hypersil BDS C18作为分析谱柱。
2.3 流动相的选择
考察了甲醇-水、乙腈-水、乙酸铵-甲醇、磷酸二氢钾-甲醇等流动相对13种酚酸谱分离的影响。结果表明，以甲醇-水、乙腈-水和磷酸二氢钾-甲醇作为流动相时，部分谱峰拖尾，13种酚酸化合物的谱峰不能实现有效分离，单个化合物出现双峰；以乙酸铵-甲醇为
流动相时，表现出较好的分离和洗脱能力，当乙酸铵浓度为10 mmol/L时，13种酚酸的谱峰可得到较好的分离，基线平稳且谱峰峰形尖锐对称（图1）。因此选择乙酸铵-甲醇作为流动相。
图1 13种酚酸标准液相谱图Fig.1 Chromatograms of 13 standard phenolic acid
2.4 萃取溶剂的选择
考察了甲醇、乙腈、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂对13种酚酸的萃取效果（图2）。
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