陈莹蓉1，马越鸣133，张宁2，贾伟3，李国文2
(11上海中医药大学中药药代动力学实验室，上海201203;21上海中医药大学科技实验中心，上海201203; 31上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心，上海201203)
摘要 目的：建立同时测定大鼠血浆中桂皮酸和马尿酸浓度的高效液相谱法。方法：血浆样品用盐酸和乙酸乙酯萃取，采用S UPE LCO D iscovery C 18
柱(5μm,416mm×250mm)，以0105%磷酸-乙腈为流动相梯度洗脱，流速110mL・m in-1；以对羟基苯甲酸甲酯为内标，在230n m(马尿酸)和278n m(桂皮酸)波长下进行检测。结果：桂皮酸的线性范围为0105～510μg・mL-1(r=019987)，最低定量限为0105μg・mL-1，方法回收率为8715%～10214%，绝对回收率大于80%，日内和日间的RS D 均小于1311%；马尿酸的线性范围为012～2010μg・mL-1(r=019957)，最低定量限为012μg・mL-1，方法回收率为9612%～10116%，绝对回收率大于70%，日内和日间的RS D均小于814%。血浆样品的稳定性符合要求。结论：所建立的大鼠血浆中桂皮酸和
马尿酸浓度的HP LC测定方法灵敏、准确、精密、稳定，并适用于大鼠体内桂枝的药代动力学研究。
关键词：桂皮酸；马尿酸；桂枝；药代动力学；高效液相谱法
中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2009)02-0212-05
HP LC deter m i n ati on of ci n nam i c aci d and hi ppuri c aci d i n rat pl as ma3 CHEN Ying-r ong1,MA Yue-m ing133,ZHANG N ing2,J IA W ei3,L I Guo-wen2 (11Laborat ory of Phar macokinetics,Shanghai University of Traditi onal Chinese Medicine,Shanghai201203,China;
21Center of Science and Technol ogy Experi m ent,Shanghai University of Traditi onal Chinese Medicine,Shanghai201203,China;水产品包装设计
31Center f or Traditi onal Chinese Medicine and System s B i ol ogy,Shanghai University of Traditi onal Chinese Medicine,Shanghai201203,China) Abstract O bjecti ve:T o devel op a method f or the deter m inati on of cinna m ic acid and hi ppuric acid in rat p las ma by HP LC.M ethods:The separati on was carried out by using a S UPE LCO D iscovery column(5μm,416mm×250 mm)with a gradient mobile phase of0105%phos phoric acid-acet onitrile,at a fl ow rate of110mL・m in-1,and detecti on wavelengths were set at230nm(hi ppuric acid)and278nm(cinnam ic acid).Plas ma sa mp les were ex
2 tracted with hydr ochl oric acid and ethyl acetate and methyl parahydr oxybenz oate was used as an internal standard. Results:The linear range of cinna m ic acid was0105t o510μg・mL-1(r=019987)with the l ower li m it of quanti2 ficati on f or0105μg・mL-1.The method recovery was8715%t o10214%and the abs olute recovery was more than 80%.The intra-day RS D and inter-day RS D were less than1311%.For hi ppuric acid,the linear range was012 t o2010μg・mL-1(r=019957)with the l ower li m it of quantificati on for012μg・mL-1.The method recovery was 9612%t o10116%and the abs olute recovery was more than70%.The intra-day RS D and inter-day RS D were less than814%.Conclusi on:The devel oped method for the quantificati on of cinna m ic acid and hi ppuric acid in rat p las ma is sensitive,accurate,p recise,stable,and is suitable for the phar macokinetic studies of Ra mulus Cinna mom i in rats.
Key words:cinna m ic acid;hi ppuric acid;Ra mulus Cinna mom i;phar macokinetics;HP LC
桂枝(Ra mulus Cinna mom i)为樟科植物肉桂(C innam o m um cassia Presl)的干燥嫩枝[1]，具有发汗解肌、散寒止痛、温通经脉之功效[2]。临床常用的含有桂枝的复方主要有桂枝汤、麻黄汤、大青龙汤、小青龙汤、小建中汤、桃核承气汤、桂枝茯苓丸、乌梅丸等。国内外对桂枝中所含的单体化合物的药代动
3 33上海市重点学科建设项目资助(№T0301)中国职业经理人认证
通讯作者 Tel:(021)51322386;E-mail:mayue m ing_117@126
力学已有了一定的认识，但对桂枝的药代动力学还未见报道。
桂枝的主要有效成分为苯丙素类，包括桂皮醛(cinna maldehyde)、桂皮酸(cinna m ic acid)等[3]。桂皮醛是桂枝挥发油的主要成分，具有镇痛、抗真菌、抗肿瘤等作用[4]。桂皮酸是一种低毒的天然产物，有抗微生物、抗炎、抗血小板聚集的作用，还具有广泛的抗实体瘤活性[5]。
有研究报道，桂皮醛进入体内后迅速氧化为桂皮酸，经β-氧化作用后生成苯甲酸[6]，并与甘氨酸结合，再在ATP与酰基转移酶的作用下生成代谢物马尿酸，经尿液排出体外[7]。马尿酸也是尿液的主要成分之一，内源性的马尿酸可由食物中的苯甲酸代谢生成。有文献报道了大剂量桂皮醛给药后马尿酸在尿中的排泄情况[6,8]，但血浆中马尿酸的动力学规律不清楚，未见测定血浆中马尿酸的HP LC方法报道；测定血浆中桂皮酸的方法已有报道，但同时测定血浆中桂皮酸和马尿酸的HP LC方法还未见报道，桂枝中桂皮酸及其代谢物马尿酸的药动学规律不清楚。为阐明桂枝主要成分桂皮酸及其代谢产物马尿酸的血药动力学规律，本文建立了同时测定大鼠血浆中桂皮酸和马尿酸的HP LC方法，并用于桂枝的药代动力学研究。
1 材料
111 仪器 W aters A lliance高效液相谱系统：包括2695溶剂输送系统、2487紫外检测器和Epower2谱工作站;WATERS公司UP LC-MS，配有ESI及APC I源,Masslynx数据处理系统;DZF-605型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;X W-80A旋涡混合器，上海医科大学仪器厂;USC-502超声波清洗器，上海波龙电子设备有限公司;F A2004N分析天平，上海精密科学有限公司;TG L-16G-A型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。
112 药品 对照品桂皮酸(纯度≥9915%)和内标对羟基苯甲酸甲酯(内标，纯度≥9815%)均购于中国医药集团上海化学试剂公司，对照品马尿酸(纯度≥9815%)购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈为谱纯，其余试剂为分析纯，实验用水为超纯水。桂枝购于上海养和堂中药饮片有限公司，用挥发油提取器提取得桂枝水提粉末及芳香水，芳香水冰箱冷冻，灌胃给药时两者按比例混合，经HP LC含量测定，桂皮酸的含量为1153mg・g-1，桂皮醛的含量为0132mg・g-1，未检测到马尿酸。113 动物 清洁级S D大鼠，体重(245±15)g，雌雄各半，合格证号:SCXK沪2003-0002，由上海中医药大学实验动物中心提供。灌胃前禁食12h，自由饮水。
2 方法和结果
211 谱条件 谱柱:S UPE LCO D iscovery C18柱(5μm,416mm×250mm)，柱温30℃；流动相: 0105%磷酸-乙腈,0m in到18m in乙腈由15%线性上升至50%；流速110mL・m in-1，紫外检测波长230n m(马尿酸)和278n m(桂皮酸)，进样50μL。212 溶液的配制及样品处理
21211 对照品储备液 精密称取对照品桂皮酸、马尿酸和对羟基苯酸甲酯适量，分别用甲醇溶解配制成110,410,012mg・mL-1的单一对照品储备液，保存于4℃冰箱，备用。
21212 血浆样品预处理 取血浆012mL，加入1 mol・L-1盐酸60μL、内标溶液(10μg・mL-1对羟基苯甲酸甲酯甲醇溶液)50μL、乙酸乙酯1mL，涡旋1m in，离心(16000r・m in-1)10m in，吸取上清液吹干，残渣用200μL流动相复溶，涡旋1m in，离心(16000r・m in-1)10m in，取上清液即得。
213 方法学考察
21311 专属性 记录桂皮酸和马尿酸对照品、空白血浆、空白血浆加对照品和给药后血浆的谱图，考察分析方法的专属性。结果(图1)表明，空白血浆谱图中在与桂皮酸对照品相同保留时间处没有检测出谱峰，桂皮酸与其他成分达到基线分离，说明血浆中内源性物质、代谢产物及桂枝中的其他成分均不干扰桂皮酸的检测。空白血浆谱图中在与马尿酸对照品相同保留时间处检测出了谱峰，经LC -MS测定，确认该成分即为血浆中内源性的马尿酸。又经多份空白血浆样品测定，该峰每份空白血浆样品的峰面积相对小而恒定，故不影响马尿酸的检测。
21312 线性关系与定量限 取以甲醇稀释的一系列浓度的桂皮酸、马尿酸对照品溶液各200μL，吹干，加入空白血浆200μL，配制成桂皮酸浓度分别0105,011,012,015,1125,215,510μg・mL-1及马尿酸浓度分别为0,012,014,210,410,1010,2010μg・mL-1的对照品血浆，按“血浆样品预处理”的方法操作，
利用各成分浓度Y对各成分与内标峰面积比X 作直线回归，得标准曲线。用加权最小二乘法(w= 1/c)进行线性回归运算求得桂皮酸标准曲线回归方程:
图1 桂皮酸和马尿酸的谱图
Fig1 HP LC chr omat ogra m s of cinna m ic acid and hi ppuric acid
A.对照品(reference substances)
B.空白血浆(blank p las ma)
C.空白血浆+对照品+内标(blank p las ma s p iked with reference substances and internal standard)
D.桂枝以714g・kg-1灌胃给药后30m in血浆样品(p las ma samp le30m in after ig adm inistrati on of714g・kg-1Ra mulus Cin2 namom i)
1.内标(internal standard)
2.桂皮酸(cinna m ic acid)
3.马尿酸(hi ppuric acid)
Y=11696X+01106 r=019987(n=5)
空白血浆中的马尿酸峰面积相对小而恒定，通过空白血浆扣除的方法，马尿酸标准曲线回归方程:
Y=01852X+01355 r=019957(n=5)
结果表明桂皮酸和马尿酸血浆浓度分别在0105～510μg・mL-1及012～2010μg・mL-1范围内线性关系良好，桂皮酸的定量下限(LLOQ)为0105μg・mL-1，马尿酸的定量下限(LLOQ)为012μg・mL-1。
21313 精密度、相对与绝对回收率 分别制备桂皮酸011,015,215μg・mL-1、马尿酸012,210,1010μg・mL-13个浓度的对照品血浆，按“血浆样品预处理”项下方法操作，批内每个浓度平行5份，用于评价方法的批内相对回收率和精密度；每日每个浓度平行5份，连续测定3d，计算批间相对回收率和精密度。同法制备对照品血浆，按“血浆样品预处理”项下方法操作，进样测定，得各成分峰面积A
1
；另取桂皮酸和马尿酸各3种不同浓度的对照品溶液200μL吹干，加入200μL流动相复溶，使其浓度与
对照品血浆相同，进样测定，得样品峰面积A
2
，以A1/A2×100%求得低、中、高3个浓度血浆的绝对回收率，见表1。
表1 大鼠血浆中桂皮酸及马尿酸的回收率和精密度
Tab1 Recovery and prec isi on of c i n nam i c ac i d and h i ppur i c ac i d i n ra t pl a s ma
成分(component)
浓度
(concetrati on)
7900gtx
/μg・mL-1
绝对回收率(abs olute recovery)方法回收率(method recovery)
均值(mean)±
S D/%
(n=5)
RS D
/%
日内(inter-day)(n=5)日间(intra-day)(n=15)
均值(mean)
±S D/%
RS D
/%
均值(mean)
±S D/%
RS D
/
%
桂皮酸(cinna m ic0118019±3194189315±81181710214±13151311 acid)0158415±2163108911±4155118715±9101012 2158510±21731210010±4184189215±9151013马尿酸(hi ppuric0127115±2143139812±5105119612±811814 acid)2107212±6148199812±61261310116±610519 10107413±4115159815±6186199815±417418
21314 稳定性 配制与“精密度、准确度与回收率”项下相同浓度的桂皮酸和马尿酸对照品血浆，分别在室温放置12h、-70℃冰箱放置7d和经“血浆样品处理”后在进样器(4℃)中放置24h，考察稳定性。结果表明在上述3种条件下保存浓度无明显变化，稳定性良好,RS D均小于12%。21315 方法学质控 在生物样本分析方法确证完成以后开始测定未知样品，同时进行质量控制。每个分析批生物样品测定时建立新的标准曲线，并进行三浓度双样本质控样品分析，并将质控样品方法回收率的RS D<15%作为当日数据是否接受的标准。结果表明每批样品测定的质控符合要求。
214 桂枝在大鼠体内的药代动力学试验陈颖异
大鼠6只，雌雄各半，实验前禁食12h，不禁水,
灌服桂枝714g ・kg -1(桂皮酸11130mg ・kg -1
，桂
皮醛2141mg ・kg -1
)，于给药前和给药后2,5,10,20,30,60,90,120,180,240m in 于眼球后静脉丛采
血，肝素抗凝，制备血浆，按前述方法处理测定。通
过大鼠灌服桂枝后血浆谱图与空白血浆谱图进行对比，并通过与桂皮酸、马尿酸对照品进行对比确认，分析桂枝吸收进血液的成分；由随行标准曲线计算出桂皮酸、马尿酸的血药浓度。21411 桂枝体内成分分析 大鼠灌服桂枝后，血浆HP LC 分析成分谱见图1，通过与空白血浆对比分析，并经对照品确认，血浆中可检测到桂皮酸和马尿酸。21412 血浆桂皮酸和马尿酸浓度经时变化 大鼠灌服桂枝后，桂皮酸可迅速吸收进入体内，并代谢产生马尿酸,2m in 即可检测到，并随时间呈动态变化。桂皮酸和马尿酸浓度-时间曲线见图2。用统计矩法计算得其主要药代动力学参数，桂皮酸和马
尿酸的C max 分别为(21124±15124)mg ・L -1
和(22102±6113)mg ・L -1
,T max 分别为(713±619)m in 和(1010±515)m in,t 1/2分别为(1918±517)m in 和(2010±710)m in,AUC (0-t )分别为(37816±20617)mg ・L
-1
・m in 和(63418±16615)mg ・L
-1
・m in
。
图2 大鼠灌胃714g ・kg -1桂枝后的平均血药浓度-时间曲线(x ±s ,n =6)
Fig 2 Average p las ma concentrati on -ti m e curves of cinna m ic acid and hi ppuric acid after ig adm inistrati on of Ra mulus Cinna mom i (714g ・kg -1)in rats (x ±s ,n =6)
1.桂皮酸(cinnam ic acid )
2.马尿酸(hi ppuric acid )
3 讨论
经过查阅文献，发现血浆中桂皮酸的测定方法
已有报道，但马尿酸的测定多为尿中的方法，未发现同时测定血浆中两者的HP LC 方法。本次实验改进了文献中已有记载的桂皮酸血浆测定方法，建立了同时测定血浆中桂皮酸及马尿酸的方法。根据文献
报道的萃取方法，本实验对3种萃取方法进行了提取回收率的比较。3种方法的提取溶剂分别为甲醇
-乙腈[9]、正己烷-氯仿-异丙醇(15∶10∶1)[10]
经济效益和社会效益和乙酸乙酯
[11]
，结果表明盐酸酸化后用乙酸乙酯提取
桂皮酸和马尿酸的回收率均大于其他2种方法。故选用该方法为血浆样品的提取方法。经实验筛选大
量的内标物，结果发现以对羟基苯甲酸甲酯作为内标物，桂皮酸和马尿酸的分离度好，测定时不受干扰，保留时间适宜。又比较了纯水-乙腈、011%磷酸-乙腈和0105%磷酸-乙腈作为流动相，结果表明0105%磷酸-乙腈作为流动相时各成分分离良好，故选为本次实验的流动相。经紫外扫描，桂皮酸和马尿酸分别在278nm 和230n m 处有最大吸收，故本实验采用双波长检测，使该2种成分在各自最大吸收波长处检测，便于对血浆中的桂皮酸和马尿酸进行准确测定。
从实验结果可以看出，大鼠灌服桂枝后,2m in 即可在血浆中检测到桂皮酸和马尿酸，说明桂皮酸吸收迅速，并迅速转化为马尿酸;5m in 后马尿酸在体内的血药浓度高于桂皮酸。马尿酸可为内源性物质，经研究表明，正常个体的马尿酸排泄量与年龄和性别无关，个体差异很小，主要受食物中苯甲酸的摄入量的影响
[12]
荷电。经实验证明，禁食12h 后的大鼠
血浆中内源性的马尿酸与给药后血浆中的马尿酸比较仅为微量，随时间波动不大，且个体差异不明显，因此，内源性的马尿酸不影响给药后桂皮酸代谢物马尿酸的血药浓度测定。
本文报道了桂枝口服给药后桂皮酸及其代谢物马尿酸的血药动力学规律。所获得的桂皮酸药动学参数与文献报道的小鼠纯品桂皮酸灌服后的参
数[9]
相比，消除参数(t 1/2)相近；由于文献中桂皮酸
剂量(450mg ・kg -1
)明显高于本研究中所含桂皮
酸剂量(11130mg ・kg -1
)，通过剂量折算后，本研究
中桂皮酸的AUC 和C max 明显高于文献中结果。其原因有待进一步研究阐明。
本文首次建立了同时测定大鼠血浆中桂皮酸和马尿酸的高效液相谱方法，该方法符合生物样品检测要求，为进一步研究桂枝乃至含桂枝中药复方的药代动力学奠定了基础。
参考文献
1
L I U J iang -yun (刘江云),Y ANG Xue -dong (杨学东),XU L i -zhen (徐丽珍),et al .Studies on che m ical constituents in dried ten 2der ste m of Cinna momum cassia (桂枝的化学成分研究).Chin
Tradit Herb D rugs(中草药),2002,33(8):681
2L I N Jia(林佳),XU L i-zhen(徐丽珍),LU J iang-yun(刘江云),et al.Study on contents of cinna maldehyde and cinnam ic acid and distributi on of Ra mulus Cinna mom i(桂枝中桂皮醛、肉桂酸的含量与分布研究).Chin Phar m J(中国药学杂志),2005,40
(23):1784
3Y ANG Song(杨松),J I A Ying(贾英),B I Kai-shun(毕开顺).
RP-HP LC deter m inati on of4active components in Ra mulus Cin2 na mom i(RP-HP LC法测定桂枝中4种活性成分的含量).Chin J Phar m A nal(药物分析杂志),2004,24(2):143
4HUANG J ing-qun(黄敬),WANG Si-wang(王四旺).Ad2 vances in study on phar macol ogical effects of cinna maldehyde(桂皮醛药理研究进展).China N e w M ed(中国新医药),2004,3
(9):61
5Hoskins JA.The occurrence metabolis m and t oxicity of cinnam ic acid and related compounds.A ppl Toxicol,1994,8(4):283
6Yuan JH,D ieter MP,Bucher JR.Toxicokinetics of cinna maldehyde in F344rats.Food Che m Toxicol,1992,30(12):997
7Y ANG Jun(杨军),ZHENG Fa-lei(郑法雷).H i ppuric acid and ure m ia(马尿酸与尿毒症).Foreign M ed Sci(U rinary Syst)(国外医学泌尿系统分册),1989,9(4):145
8Sap ienza PP,I keda GJ,W arr P I,et al.Tissue distributi on and excre2
ti on of14C-labelled cinna m ic aldehyde foll owing single and multi2 p le oral adm inistrati on in male Fischer344rats.Food Che m Toxi2 col,1993,31(4):253
9FENG Hui-p ing(冯慧萍),HUANG Chao-lun(黄超伦), ZHANG Lan-t ong(张兰桐),et al.Phar macokinetics and bi oavail2 ability of cinna m ic acid in m ice(桂皮酸的药代动力学和生物利用度研究).J China Phar m U niv(中国药科大学学报),2004,35
(4):328
10 C ILei(慈磊),T ANG Xing(唐星),HE Zhong-gui(何仲贵).
HP LC deter m inati on of cinna m ic acid in human p las ma(HP LC法测定人血浆中桂皮酸的浓度).Chin J Phar m Anal(药物分析杂志),2004,24(1):84
11 DA I Rong-hua(戴荣华),S ONG Zong-hua(宋宗华),JU Tao (鞠涛),et al.Deter m inati on of p las ma concentrati on of cinna m ic acid by high-perf or mance liquid chr omat ography and its phar maco2 kinetics in rats after oral adm inistrati on of Zi-Shen p ill(滋肾丸中肉桂酸在大鼠体内的测定及药动学研究).J Chin Phar m Sci (中国药学英文版),2004,13(2):130
12 Szadkowski D,Borka mp A,Lehnert G.Excreti on of hi ppuric acid de2 pending on circadian rhythm and nutriti onal effects.Int A rch O ccup Environ Health,1980,45:141
(本文于2007年11月15日收到)
“乙型肝炎疫苗免疫效果影响因素和加强免疫策略研究”项目
获2008年中华医学科技二等奖
2009年1月9日下午，中华医学会在人民大会堂隆重举行中华医学科技奖(2008)颁奖大会，全国人大副委员长韩启德院士、卫生部陈竺部长等出席大会并为获奖代表颁奖。中国药品生物制品检定所梁争论研究员作为获奖代表参加了大会。
中国药品生物制品检定所为第一完成单位完成的“乙型肝炎疫苗免疫效果影响因素和加强免疫策略研究”项目(主要完成人：梁争论、庄辉、李杰、胡忠玉、张瑞、廖雪雁、朱凤才、李荣成、荆庆、吴小音等)获2008年度中华医学科技二等奖。该项目采用分子生物学和现场流行病学结合的研究方法，建立了敏感、特异的病毒变异株和基因型检测技术，规范了细胞免疫检测方法，结合现场流行病学调查，对影响我国乙肝疫苗免疫效果的主要因素进行了研究。研究结果为我国乙肝疫苗生产研发单位提供了乙肝疫苗进一步发展方向，对推广、规范我国乙肝疫苗预防工作发挥了积极作用，对我国创新型性乙肝疫苗的研制起到了促进作用，也为疫苗管理和应用部门的相关决策提供技术依据。
(中国药品生物制品检定所科研处供稿)
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